非脱灰硬組織凍結切片標本作製技術 硬組織凍結切片 - Section-lab

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Section-lab technical note (1)
【病理技術 72 巻 2 号 p.76-83、2009】
(July 24th, 2009)
非脱灰
硬組織凍結切片標本作製技術
( 川 本 法 2 0 0 8 ) とその応用
非脱灰硬組織凍結切片標本作製技術
硬組織凍結切片標本作製技術(
川 本 忠 文
序 言
老齢化に伴う骨粗鬆症や骨欠損部の再生等で、骨組織
の 研 究 が 重 要 に な っ て い る 。 骨 組 織 は 、軟 組 織 と 異 な り
化学固定後、脱灰操作を行わなくては切片標本を作製す
る こ と が で き な い 。 し か し 、化 学 固 定 や 脱 灰 操 作 は 、生
体成分の溶出や蛋白の変性を引き起こすとともに組織か
ら 多 く の 情 報 を 失 わ せ 、酵 素 組 織 化 学 染 色 、 免 疫 組 織 化
学染色、遺伝子組織化学染色等の結果に影響を及ぼす。
切 片 か ら 正 確 な 情 報 を 得 る に は 、未 固 定 非 脱 灰 の 新 鮮 試
料から切片を作製することが望ましく、凍結切片作製法
は、それに適した方法である。従来の凍結切片作製法
は 、軟 組 織 か ら 凍 結 切 片 を 作 製 す る こ と が で き る が 、 硬
組織からの凍結切片作製は極めて困難である。
著 者 が 開 発 実 用 化 し た 凍 結 切 片 作 製 法 1 - 4) は 、 強 力
な粘着フィルム(C r y o f i l m )を切片支持材として用い 5)、
薄切時の切片の損傷を回避しながら切片を作製すること
が で き る 。そ の た め 骨 組 織 を 含 め 、種 々 の 試 料 か ら 形 が
正確に保たれた凍結切片(厚さ2μ m 程度まで)を容易
に、しかも確実に作製することができる。切片は粘着
フィルムに貼りついた状態で染色され、最終的に粘着
フィルムとスライドグラスの間に専用封入剤を用いて永
久保存される。さらにカバーグラス下に封入することも
で き る 。 本 法 の 凍 結 包 埋・ 凍 結 薄 切・ 染 色 封 入 の 一 連 の
所要時間は約 2 0 分で、試料採取 2 0 分後には永久切片標
本 と し て 顕 微 鏡 で 詳 細 に 観 察 で き る 6 )。
本稿では、著者が開発した非脱灰硬組織切片標本作製
法の基本的手技について述べる。
図1 凍結切片標本作製手順
材料と方法
図1に試料凍結から切片封入までの一連の手順を示し
ている。本法では、専用凍結包埋剤(S C E M )、凍結切
1)凍結包埋(図2)
・試料をステンレス製凍結カゴに入れ、表1に示す冷却
片支持用粘着フィルム(C r y o f i l m )、タングステンカー
バイド製替刃ナイフ(T C - 6 5 ) 、専用水溶性封入剤
液に入れて急速凍結する(図2‐A) 。
・冷蔵庫で冷却した専用包埋剤(S C E M , ラ イ カ マ イ ク ロ シ ス テ ム ス ゙
(S C M M )を使用することにより硬組織凍結切片を作製
す る 。こ の 凍 結 切 片 作 製 過 程 に は 特 別 な 技 術 、 熟 練 を 必
(株)、S e c t i o n - L a b 製)をステンレス製包埋容器に入
れ、少し凍結する(図2−B) 。
要 と し な い こ と か ら 、 切 片 標 本 作 製 で 最 も 重 要 な 事 は 、 ( 注 ): 試 料 の 大 き さ に 合 っ た 包 埋 容 器 を 使 用 す る 。
氷 晶 の 少 な い 良 好 な 凍 結 包 埋 試 料 を 作 る こ と で あ る 。以 ・凍結試料表面の冷却液を拭き取り、直ちに包埋剤中に
入 れ 、包 埋 容 器 を 冷 却 液 に 沈 め て 5 ∼ 1 0 秒間程凍結
後に各手順を示している。
する。
(注):液体窒素等の超低温冷却液は、凍結ブロックにク
ラックができるので包埋剤の凍結には使用しない。
鶴見大学・歯学部・RI研究センター
横浜市鶴見区鶴見 2-1-3
e-mail: [email protected]
1
図2 凍結包埋手順 A : 試料の急速凍結、 B : 包埋剤を少し凍結する(矢印が凍結部位)、 C : 凍結包埋、D :凍結包埋試
料の取出し、E :試料ホルダーへ固定
図3 凍結薄切手順 A : 粘着フィルムの準備、B : 粘着フィルムの貼付、 C : 凍結薄切、 D :凍結切片の解凍、 E :切片の固定(1 0 0 %エタノールに入れ、次いで P F A に入れる)
表1 試料凍結用冷却液
表2 切片支持用粘着フィルム
・表面の一部が凍結した時、包埋容器を液面まで引き上げ、
包埋剤を完全に凍結する(図2‐C) 。
・包埋容器から凍結ブロックを取り出す(図2‐D) 。
3)凍結切片の処理(図5)
凍結切片は、使用目的に応じて半乾燥、完全乾燥、あ
る い は 凍 結 乾 燥 を 行 う ( 図 1 )。
・凍結試料の上面を試料ホルダーに押し付けて一部を解
凍し、次いで冷却液に入れて凍結する(図2‐E) 。
A ) 半 乾 燥 ( 通 常 の 組 織 学 的 染 色 、 免 疫 染 色 等 を 行 う
場合)
2)凍結薄切(図3)
・専用替刃ホルダーにタングステンカーバイド製替刃(T C 65, ライカマイクロシステムズ(株))を装着し、試料をトリミングす
・凍結切片をクリオスタットから取り出して解凍する
( 図 3 ‐ D )。
・室温で 1 0 ∼ 6 0 秒間乾燥する。
( 注 ): 乾 燥 時 間 は 試 料 に よ り 決 定 す る 。
・ 乾 燥 後 、切 片 面 を 下 に 向 け て 1 0 0 % エ タ ノ ー ル に 入
れる。
る。
(注):最適薄切温度は試料により異なり、硬組織薄切温度
は− 20℃∼− 25℃、軟組織は− 17℃∼− 20℃程度を
目安とする。
・次いで固定液(PFA 等)に移して固定する(図3‐E)。
B) 完全乾燥 (染色中に切片が粘着フィルムから剥離する
・トリミング後、切片採取用の替刃に交換する。
・実験目的に適した粘着フィルム(Cryofilm, ライカマイクロシステ
場合)
・凍結切片をクリオスタットから取り出して解凍する。
ムズ(株)、Section-Lab 製)を選択する(表2)。
・薄切面の大きさに合わせて粘着シートを切断する(図3‐
・室温で数分間乾燥する。
・ 乾 燥 後 、切 片 面 を 下 に 向 け て 1 0 0 % エ タ ノ ー ル に 入
A)。
・剥離紙を取り除き、粘着フィルムと試料面の間に空気を
れる。
・次いで固定液(PFA 等)に移して固定する(図3‐E)。
取り込まないように粘着フィルムを試料面に密着する
(図3‐B)。
C) 凍結乾燥 (未固定非脱灰状態で免疫染色する場合、 水
溶性物質の分布を研究する場合)
・できるだけゆっくりと、一定速度で薄切する(図3‐C)。
・凍結切片をクリオスタット内の温度の低い場所(‐20℃
2
図4 切片封入手順
が 不 要 )、 A : 従来の封入手順、 B : 新封入剤(S C M M - R 2 , R 3 ) による封入手順(脱水、置換操作
図5 染色・封入
A : H - E 染色、 B : 水洗、C :S C M M - R 2 による封入、D :余剰封入剤の除去(スライドグラスを垂直
に 立て る )、 E :余 剰 封 入 剤 の 除 去 ( 濾紙 に よ る除 去 )
以下)に置く。
表3 新封入剤
・凍結乾燥を行う。
(注):厚さ5μm程度であれば数時間で凍結乾燥する。
乾燥時間が長くなると組織にクラックが現れるので
乾燥時間に注意する。
・乾燥後、シリカゲルを入れた密閉容器に入れて取り出
す。
・アルコールまたはアセトンへの浸漬後、緩衝液に移し、
次いで免疫染色等を行う。
4 ) 組 織 学 的 染 色 ( H - E 染 色 )( C r y o f i l m
t y p e 2 C を使用)
(注):切片が乾燥しないように迅速に行う。トルイジンブ
ルー染色には S C M M − R 3 を使用する。
・粘着フィルムの切片面をスライドグラスに向け、気泡を
・粘着フィルムの切片面を上に向け、クリップでスライド
取り込まないようにスライドグラス上に置く(図4‐C
2、5‐C) 。
グラスに固定し、水洗する。
・水洗後、クリップを取り外し、切片上にヘマトキシリン
・スライドグラスをキムタオル等の吸収紙上に立て、余分
な封入剤を除去する(余分な封入剤が流れ出る)(図5‐
を滴下して2∼4分間染色する(図5‐A) 。
(注):大量処理の場合は、染色液を入れたタッパ等に切片
D)。
・更に、濾紙を使って余分な封入剤を吸収除去する(図4‐
面を下に向け、浮かべて染色する。
・染色後、切片をクリップでスライドグラスに固定し、流
水中で4∼ 1 0 分間水洗する(図5‐B) 。
・水溶性エオジンで 1 0 ∼ 2 0 秒間染色する。
C3、5‐E) 。
・専用封入装置(UV Quick Cryosection Mounter,
ライカマ
イクロシステムズ(株)、Section-Lab 製)に切片を置き、封入剤
を重合硬化する(約 1 分)(図4‐C4、6−A)。
・流水でエオジンを洗い流す(1 0 ∼ 2 0 秒)。
・100% エタノールを切片上に滴下し、粘着面に付着した
・重合後、水道水でフィルム上とスライドグラス上の封入
剤を洗い流す(しっかりと洗う)。
エオジンを洗浄除去する(1 0 ∼ 2 0 秒)。
・専用封入剤(SCMM − R2, ライカマイクロシステムズ(株)、Section-
・粘着フィルムの余分な部分(両端の金色部分)を切り取
る(粘着フィルムがカバーグラスの代わりとなる)。
L a b 製)を切片上と新しいスライドグラス上に滴下する
(図4‐C1) 。
・必要に応じて、パラフィン用封入剤でカバーグラス下に
再封入する。
3
図7 LMDフィルム使用による微小試料採取(切片面を
レーザー光側にする)。A: 穴あきアクリル板使用、 B: スラ
イドグラス使用
図6 迅速切片封入装置(A ) と非脱灰骨切片の封入例(トルイ
ジンブルー染色)、B1:グリセリン系封入剤(SCMM-G1)使用、 B2:樹脂系封入剤(SCMM-R3)使用。 B1 では石灰化部位にすだ
れ状の模様(矢印)が現れているが、B2 では骨組織を鮮明に観
察できる。
法を使用することにより試料採取から 2 0 分で非脱灰永
5 )免 疫 染 色(C r y o f i l m t y p e 2 C を 使 用 )
・ 染 色 手 順 は 、 基 本 的 に は 4 )( 組 織 学 的 染 色 ) と 同 じ
で、スライドグラス上に置いた切片に順次反応液を
久切片標本を作製することができるようになった。しか
も最も難しい切片作製に専用粘着フィルム(Cryofilm)
滴下し、染色する。未固定非脱灰状態で免疫染色する
場合は、凍結乾燥切片を使用する。
・ 切 片 封 入 に は 、 A B C 法 等 で 染 色 し た 場 合 は 、樹 脂 系
を使用するために形態が正確に保たれた切片を確実(ほ
ぼ 100%)に採取でき、厚さ2μ m までの切片作製がで
きる。
封入剤(S C M M − R 1 , R 2 , R 3 )を使用できる。蛍光免
疫染色については、従来の市販の封入剤を使用する。
凍結包埋、凍結薄切、専用封入剤による封入等の各操
作では脱水操作がないために組織収縮が殆ど起こらな
試料により S C M M − R 2 で封入することもできる。
い。また切片が粘着フィルムに貼りついた状態で、染色、
封入等の一連の操作を行うために切片の変形は起こら
6)蛍光トレーサー、水溶性トレーサー等の観察
・凍結乾燥切片をシリカゲルを入れた密閉容器に入れ、
ず、作製された切片標本は正確に生体内の形態を保って
いる。図 8,9,10,11 に本法で作製した切片標本例を示
クリオスタットから取り出す。
・3∼5分間の放置後、粘着フィルム上の切片をスラ
している。
図8は成熟ラットの足で、厚さ4μ m の新鮮凍結切片
イドグラスに向けて置き、粘着フィルムの粘着力を
利用して切片を粘着フィルムとスライドグラスの間
標本を示している。骨、筋肉、皮膚、爪、関節軟骨等の
位置関係は正確に保たれ、形態も良好で、顕微鏡により
詳細に観察することができる。拡大図に示しているよう
に切片作製で難しいとされる爪や骨の形態も良好に保た
に密閉保存する。
( 注 ): 封 入 剤 は 用 い な い 。
れている。関節部の軟骨の形態も良好に保たれている。
図9は同じラットの大腿骨で、厚さ4μ m 凍結切片標
7)遺伝子解析用試料採取
・L M D フィルムで凍結切片を採取する。
・凍結乾燥後、図7に示すように切片面をレーザー光
本を示している。骨幹部、骨端部、軟骨等がほぼ完全に
保たれている。石灰化組織は、アリザリンレッドS染色
が示しているように完全に保たれている(図9−B)。膝
関節部の骨、軟骨、靭帯等の形態や位置関係は良好に保
側に向けて L M D フィルムをスライドグラスに固定する。
(注):スライドグラスを使用する場合は、切片とスライド
たれ、各細胞を明瞭に観察することができる。硬組織の
石灰化描記に使用される蛍光トレーサーの分布も明瞭に
グラス板の間に隙間を設ける(図7‐B )。
・L M D 装置で目的部位を切断し、切断片を採取する。
結果および考察
観察することができる(図9−D)。図示していないが、
厚さ2μ m の切片でも鮮明な蛍光像を観察することがで
従来の硬組織切片標本作製法では、脱灰試料、非脱灰試
料ともに切片標本作製には 1 週間以上を必要とするが、本
きる。骨髄の凍結切片作製は極めて困難であるが、図9
−AとCに示しているように骨髄中の各細胞は完全に保
4
図8 7ヶ月齢ラット足(未固定非脱灰凍結切片、4μ m ) A:H−E染色、B:アリザリンレッドS染色、
C:トルイジンブルー染色、右挿入図は各矢印部位の拡大図、 切片採取フィルムは全て Cryofilm type 2C(9), 封入剤:図A,Bは SCMM-R2、図Cは SCMM-R3 図 1 0 は生体で最も硬い成人の抜去歯で、厚さ5μ m の
凍結切片標本を示している。象牙質、エナメル質の両硬組
1)凍結包埋
試料の凍結包埋で最も大きな問題は、氷晶形成による
組織損傷である。特に未固定試料は、その損傷が顕著に
織の形態は保たれ、象牙質の齲触状態を明瞭に観察する
ことができる(図 1 0 − A の矢印)。
現れる。組織を環流固定し、氷晶防止剤に浸漬した試料
を凍結すると、光学顕微鏡レベルでは ほぼ完全に氷晶
図 1 1 は全身切片への応用例として7日齢マウスの新鮮
凍結切片標本を示している。全ての臓器、組織の位置関係
形成による損傷を回避することができる。しかし、化学
固定は、免疫染色等に影響を与える場合があり、可能な
は正確に保たれ、組織も良好に保たれている。切片作製で
難しいとされる肺胞の形態も良好に保たれている(図 1 1
限り短時間の固定にすべきである。氷晶形成による組織
損傷は、試料の凍結速度を高めることにより小さくする
−D)。
図 8,9,10,11 に示しているように、本法は軟組織と硬組
ことができる。液体窒素は極低温なので冷却速度が高い
ように思われているが、試料凍結時に生じるバブルによ
織が混在した試料からでも全ての組織の位置関係を正確
に保ち、組織収縮もなく、しかも高倍率で詳細に観察でき
り熱伝導が妨げられ、冷却速度はイソペンタンよりも悪
い 8) 。
る凍結切片を作製することができる。切片は、組織化学的
染色、酵素組織化学、免疫組織化学、蛍光免疫組織化学、
凍結包埋用冷却液としては、表1のような液が使用さ
れる。液体窒素冷却プロパンで凍結した試料は最も美し
遺伝子組織化学等に使用することができる。免疫染色で
は、固定や脱灰の影響がないために従来の方法で作製し
い組織像を示すが、実用的には安全面等を含めて液体窒
素冷却イソペンタンやペンタンで十分である。専用装置
た切片よりも良い結果が得られている 7 )。
以後、凍結包埋、凍結薄切、染色について考察する。
で冷却したヘキサン(− 94℃)でも問題なく各細胞を同
定できるが、新鮮試料を凍結した場合、氷晶の影響を受
たれている。
5
図9 7ヶ月齢ラット大腿骨(未固定非脱灰凍結切片、4μ m) A:H−E染色、B:アリザリンレッドS染色、C:トルイジンブルー
染色、D:図Cの矢印部位のカルセインの蛍光分布、各挿入図は矢印部位の拡大図、 切片採取フィルムは全て Cryofilm type 2C(9), 封入剤:図A,Bは SCMM-R2、図Cは SCMM-R3 けやすい組織(例えば、赤血球や筋組織)に損傷が現れ
る。固定試料や氷晶防止剤に浸漬した試料であればドラ
イアイスで冷却したヘキサンでも問題ない。
冷却液として冷却アセトンあるいは冷却アルコールが
使用される場合があるが、それらの冷却液は凍結試料中
に浸透し、粘着フィルム貼付への障害、薄切への障害と
なるために避けなければならない。
氷晶による組織損傷は試料を化学固定することにより
小さくできる。著者の経験では、灌流固定を数分行う事
により、細胞の形態は未固定試料に比べて格段に改善し
た。実験動物を対象とする場合は、放血しないで直接固
図 1 0 成人の抜去歯、A : 薄切面(矢印は齲触部位)、 B :凍結切片(厚さ5μ m )、C : トルイジンブルー染色
定液を血管に注入し、数分間の放置後、目的試料を摘出
して直ちに凍結しても観察に耐える試料ができる。
S C E M は硬組織試料の凍結包埋剤として開発された材
料で、硬組織を十分に保持でき、しかも粘着フィルムの
以上)保存することができ、必要に応じて再薄切できる
利点がある。
貼付性に優れている。この包埋剤は切片のカーリングが
小さい、切削時の収縮が少ない等の利点があり、軟組織
試料の凍結包埋にも適している。S C E M で凍結包埋され
た試料は、凍結切片採取後、薄切面を粘着フィルムで保
2)凍結薄切
タングステンカーバイト製替刃の寿命は、試料と替刃
の取扱いにより大きく影響される。成熟ラット大腿骨で
護することにより、超低温庫(約− 80℃)に長期間(1 年
は、5μ m 以下の厚さであれば同一部位で 50 枚以上の切
6
図 1 1 7 日齢マウス(未固定非脱灰凍結切片、5μ m )、 H−E染色、図B,C,Dは矢印部位の拡大図、 切片採取フィルムは Cryofilm type 2C(9)
片を作製できる。しかし、骨組織の厚切りは一回の薄切
で刃先の鋭利さを失うため、本番用替刃(切片採取用)の
いる。
切片の P F A 中への長時間放置は細胞成分を溶出させ
て染色性が低下するので、P F A 中への切片の放置は数
面合わせに細心の注意を払わなくてはならない。また、厚
切りのトリミングは、硬組織を壊すことがあるのでトリ
時間以内とするようにする。
酵素組織化学では、未固定非脱灰切片を用いて酵素
ミング時の切片厚には注意する。著者は、目的面近くま
では 1 0 μ m 程度でトリミングし、最終段階では厚さ3∼
活 性 の 検 出 を 行 う こ と が で き る た め 、従 来 の 切 片 よ り
も 感 度 良 く 酵 素 活 性 を 検 出 で き る 。 そ の た め 、従 来 の
5 μ m で表面をしばらく整形している。
方法で検出されなかった部位に反応が現れる場合もあ
る 。解 凍 切 片 の 組 織 像 は 凍 結 乾 燥 切 片 よ り も 優 れ て い
3)染色
粘着フィルムで支持された凍結切片は、従来の切片
るので、解凍切片を未固定の状態で酵素活性の検出に
用いる場合があるが、組織により切片が粘着フィルム
を用いた研究目的(組織学的染色、一般組織化学、酵
素 組 織 化 学 、 免 疫 組 織 化 学 、遺 伝 子 組 織 化 学 、 L M D
から剥離する場合がある。その場合、凍結乾燥切片を
使用する。凍結乾燥切片の使用では、必ず凍結乾燥切
による微小試料の採取、水溶性物質の分布研究等)に
使 用 で き る 。 更 に 粘 着 フ ィ ル ム は 、免 疫 染 色 で 使 用 す
片を 1 0 0 %エタノールに入れ、それを真空容器内に置
いて組織中の気泡を除去することが必要である。また、固
る蛍光色素(FITC,DAPI 等)の蛍光領域に蛍光がないこと
から蛍光免疫染色にも使用することができる。
定液の影響が小さい場合は、短時間(数十秒)の化学固定
でも切片の剥離を防ぐことができることから、切片を P F A
通常の染色には解凍切片を使用し、解凍後の乾燥時間
は試料により決定する。例えば、脳等は完全に乾燥する
等で固定することで解決することもできる。
免疫組織化学においても免疫反応を感度よく実施する
とヒビ割れが現れる場合があり、その場合は、乾燥を 1 0
∼ 30 秒間とし、半乾燥状態の切片を使用する。半乾燥切
ことができる。特に、固定液と脱灰液の免疫反応への影
響を完全に除く事ができることから、信頼性の高い結果
片を直接固定液に浸漬すると、切片が粘着フィルムから
剥離する場合がある。これは 1 0 0 %アルコールに浸漬し
が得られる。また未固定非脱灰切片を用いて反応を実施
できることから、固定液の種類、固定時間等の免疫反応
た後、固定液に浸漬することで解決する。また、組織中
に気泡が残る場合は、100% アルコールに浸漬した状態で
に影響する因子を正確に評価することができる 7)。解凍
切片を未固定の状態で免疫染色に用いると前述のように
真空容器内で脱気する。
形態観察は、H - E 染色が一般的であるが、非脱灰切片
を H-E 染色すると石灰化部位にヘマトキシリンが沈着し、
観察しづらくなる欠点がある。そのため、骨等の石灰化
組織を観察する場合は、トルイジンブルー染色が適して
7
染色操作中に切片が粘着フィルムから剥離する場合があ
る。この場合も上記と同様の対応をする。
病理標本等では、高温処理による抗原性賦活化処理が
行われることがある。そのような試料には、表2に示し
ている粘着フィルムの Cryofilm type 2C(9))を使用する
ことにより 1 2 0 ℃による賦活処理ができる。
参 考 文 献
1 ) 川本忠文:夢の切片 −まるごと2μ m −、ミクロス
4 )封 入
本法の封入では、表3に示す水溶性封入剤を使用する
コピア , 1999, 16:11-17
2) Kawamoto T: Light microscopic autoradiography for study of
ため、従来の封入操作で使用する有機溶媒(キシレン等)
を使用しない。そのため組織収縮がほとんど起こらない。
early changes in the distribution of water-soluble materials. J
Histochem Cytochem, 1990, 38:1805-1814
また、粘着フィルムがカバーグラスの役目を果たすので、
大型ミクロトームがあれば巨大切片標本(例えば、1 5 c m
3) Kawamoto T, et al.: A method for preparing 2- to 50-μm-thick
fresh-frozen sections of large samples and undecalcified hard
× 8 c m )を容易に作製することができる。
水溶性封入剤としては、グリセリン系封入剤(SCMM-G1)
tissues. Histochem. Cell Biol, 2000, 113:331-339
4) Kawamoto T: Use of a new adhesive film for the preparation of
と樹脂系封入剤(SCMM-R1,R2,R3)がある。グリセリン系封
入剤は発色が良いが、封入剤の乾燥中あるいは保存中に
multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, wholeanimals, insects and plants. Arch Histol Cytol, 2003, Vol 66:123-
水溶性色素が拡散する欠点がある。SCMM-R1 は自然乾燥に
よる封入を行うためにグリセリン系と同様に乾燥中に水
143
5)Kawamoto T: Preparation of Multi-Purpose Fresh-Frozen Sec-
溶性色素が拡散する場合があるが、乾燥後の組織像は鮮
明で、しかも切片標本の保存中に色素の拡散は起こらな
tions By Using a New Adhesive Film. Proceeding(abstruct), 2007
Meeting of the Society for Whole-Body Autoradiography in
い利点がある。SCMM-R2 と R3 は紫外線重合型封入剤で専用
装置により 1 分で染色切片を永久標本にする事ができ、水
Charleston, 2007
6)Kawamoto T, et al.: Preparation of Thin Undecalcified Frozen
溶性色素の拡散を小さくできる。SCMM-R2 と R3 は染色によ
り使いわける。SCMM-R2 は標準的な封入剤であるが、染色
Sections from Hard Tissue. J Den Res, 2008, 84 Sp Iss
Abstruct(No 2074)
により封入操作中に水溶性色素の拡散が起こる場合があ
る。そのような場合は SCMM-R3 を使用する。
7)Hosoya A. et al.: Effects of fixation [email protected] on
the immunohistochemical localization of bone [email protected]
硬組織切片標本を鮮明に観察するには、SCMM-R2,R3 に
よる封入が必須で、グリセリン系封入剤を使用すると図
in fresh-frozen bone sections. Histochem Cell Biol, 2005,
123:639-646
6 - B 1 に示すように硬組織部位に回折光が現れ、石灰化部
位にすだれ状の像が現れて硬組織を鮮明に観察できない。
8)Schwabe K.G, et al.: Ultrastructural and thermocouple evaluation of rapid freezing tecniques. Cryobiology, 1980, 17:571-584
樹脂系封入剤(SCMM-R2,R3)では回折光は殆ど現れず、組
織を鮮明に観察することができる(図 6 - B 2 )。
終 わ り に
本原稿は、第 79 回病理技術研究会(平成 21 年 3 月 2 日)
の特別講演内容を中心に記載したものであるが、本テキ
ストのみで最新手法(川本法 2008)が使用できるように最
新技術・材料に基づいて手法を記載している。高品質の
切片が、確実に、容易に、しかも短時間で得られる本手法
が研究や臨床病理の多くの人達に役立つことを願う。
8