HPLC Troubleshooting - Thermo Scientific

HPLC and LC/MS
HPLCトラブルシューティング
HPLC
Troubleshooting
トラブルシューティングの前に、必ず、実験室に備わってい
Before you start any troubleshooting, it is essential to observe safe
る安全の手引きなどを参照してください。GCで使う溶媒など
laboratory practices. Know the chemical and physical properties of
の化学的、物理的性質がその中に書かれているし、MSDSシー
any solvents used and have the appropriate Material Safety Data
トもあるので、必ず、それらのことを知った上で行って下さ
Sheets (MSDSs) readily available. All electrically powered
い。
症状
Symptom
圧力関連Related Problems
Pressure
Low Pressure
圧が低い
原因
Cause
Low
viscosity mobile phase.
移動相の粘度が低い
Piston
seals leaking.
ピストンシールからの漏れ
Leak in system.
系内の漏れ
High
Pressure
圧が高い
High
viscosity mobile phase.
移動相粘度が大きい
Pump flow-rate malfunction.
Clean
the flow cell according to the manufacturer’s instructions.
マニュアルに従って、検出器セルを洗浄する
Equilibrate
the column with 10 volumes of mobile phase.
カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する
Degass the mobile phase and pass degassed solvent through the flow-cell.
脱気を行った移動相をフローセルに流す(セル耐圧に注意する)
Do not exceed the cell’s pressure limit.
検出器セル中に気泡
Old
detector lamp.
検出器光源ランプの劣化
Replace
the guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換する
Wash
the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
Clean
the flow cell according to the manufacturer’s instructions.
マニュアルに従って、検出器セルを洗浄する
Use
freshly prepared solvents of HPLC grade.
HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る
Replace the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours.
光源ランプの交換(特に、使用時間が2000時間を越える場合)
Use freshly prepared solvents of HPLC grade.
HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る
Gradient
mobile phase.
Consider purer solvents or higher wavelengths. Otherwise, this is normal.
グラジエントに起因
高純度溶媒を使用するか、検出波長を長波長にする。(故障ではない)
System
not equilibrated.
Equilibrate
the column with 10 volumes of mobile phase.
カラム平衡化できていない
カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する
系内の漏れ
Leak
in system.
Check
for and replace any leaking tubing or fittings.
カラムオーブンを温調する
Temperature
fluctuations.
Use
a thermostatically controlled column oven.
温度変動に起因
配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する
Contaminated
column.
Wash the column using an appropriate solvent. Ensure that a gradient method has a wash period at the end.
カラムに汚染
適切な溶媒でカラムを洗浄。グラジエントでの最後の追い出し条件をチェックする
Contaminated
solvents.
移動相溶媒の汚染
ポンプミキシング不良
Blocked
solvent reservoir frits.
リザーバ焼結フィルタ閉塞
Old
detector lamp.
検出器光源ランプの劣化
Where being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly.
溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる
If the method is isocratic, blend the solvents manually.
Ultrasonicate
the reservoir frits in water and then methanol.
リザーバーの焼結フィルタ(フリット)を水、次にMeOHを用いて、超音波洗浄する
Replace
the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours.
光源ランプの交換(特に、使用時間が2000時間を越える場合)
System
not equilibrated.
Equilibrate
the column with 10 volumes of mobile phase.
カラム平衡化できていない
カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する
Injection solvent too strong.
Ensure
that the injection solvent is the same or weaker strength than the mobile phase.
試料溶解溶媒極性が高過ぎる
試料溶解溶媒の極性は、移動相と同じか、それより低いものを使用する
Injection
volume too high.
試料注入量が多過ぎる
Reduce
the injection volume to avoid overload.
オーバーロードにならない様、試料注入量を減らす。一般にピーク幅の40%以下の注入量とする。
Typically
injection volumes of < 40% of the expected peak width should be used.
一般にピーク幅の40%以下の注入量とする
Injected
mass too high.
試料量が多過ぎる
オーバーロードとならない様、試料濃度を減らす
Reduce
the sample concentration to avoid mass overload.
Temperature
fluctuations.
温度変動に起因
Use
a thermostatically controlled column oven. Higher temperatures will produce sharper peaks.
カラムオーブンを温調する。カラム温度高いとピークはシャープになる
Extra
column volume too high.
カラム容量が大き過ぎる
Old
guard cartridge.
ガードカラムの劣化
Old
column.
カラムの劣化
Contaminated
column.
カラムの汚染
180
Replace
guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換する
System
not equilibrated.
カラム平衡化できていない
Pump not mixing solvents properly.
Negative
Peaks
負のピーク
Contact manufacturer.
Bubbles in flow cell.
Contaminated
solvents.
移動相溶媒の汚染
Double Peaks
スプリットピーク
Confirm
expected pressure using the Kozeny-Carmen or similar equation.
Kozeny-Carmen式などで、圧力をチェック、確認する
Consider
sample clarification steps such as filtration or SPE.
ろ過あるいはSPE前処理などの試料精製を行う
Detector
contamination.
検出器の汚染
Broad Peaks
ブロードピーク
Check
for and replace any leaking tubing or fittings.
配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する
Sample
precipitation.
試料からの析出物
Contaminated
column.
カラムに汚染
ピーク形状関連
Peak
Shape Problems
Confirm
expected pressure using the Kozeny-Carmen or similar equation.
Kozeny-Carmen式などで、圧力をチェック、確認する
Check
for evidence of leaking or wear and replace where necessary.
漏れ・磨耗の有無をチェックし、あれば交換する
Working
backwards from detector outlet, check source of blockage and replace item as necessary.
検出器(下流)側から、閉塞の有無を調べ、閉塞箇所を交換する
Contaminated
guard.
ガードカラムの汚染
Sloping Baseline
BLが傾いている
Action
Tubing
blocked.
配管の閉塞
Detector
blockage.
検出器の詰まり
Fluctuating Baseline
BLが変動する
解決策
溶媒ラインあるいはポンプへの気泡混入
Air
in solvent lines or pump.
Ensure
that the reservoirs and solvent lines are fully primed and the purge valve is fully closed.
リザーバーからの気泡混入の有無、パージバルブ゙が開いていないかチェックする
Guard
blocked.
ガードカラムの詰まり
ベースライン(BL)関連
Baseline Related Problems
また、電源をオフにして、プラグも抜いてから行って下さい。
instruments
should be shut down and unplugged before starting.
保護メガネも必ずして下さい。以下に、一般に良く遭遇するト
Eye
protection should also be worn.
ラブルの原因とその解決策を示しますので、トラブルシュー
Following is a chart of common HPLC problems encountered, the
ティングに役立てて下さい。
possible causes and solutions for your quick reference.
Voided
column.
カラム内に空隙が生成
Old
guard cartridge.
ガードカラムの劣化
Reduce
diameter and length of connecting tubing. Reduce the volume of the flow cell where possible.
カラム内径と接続配管の長さを減らす。可能ならばフローセル容量を減らす
Replace
the guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換する
Do
not use columns that have been used with ion-pair reagents for reverse-phase methods.
イオンペアクロマトに使用したカラムは他の逆相LC分析に使用しない。性能劣化したカラムは交換する
Old columns give much lower efficiencies than new column. Replace the column if necessary.
Wash
the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
Replace
the column. Do not use outside the recommended pH range.
カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する
Replace
the guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換する
Unbalanced
RI detector optics.
RI検出器光学系のアンバランス
Wash the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
Replace
the column. Do not use outside the recommended pH range.
カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する
Use freshly prepared solvents of HPLC grade.
移動相溶媒を新しく作り直す
Check
the signal polarity from the detector to the recording device.
検出器信号の極性をチェックする
Refer
to manufacturer’s instructions.
RI検出器マニュアルを参照してください
Ion pair method.
Inject the sample in the mobile phase.
Contaminated
column.
カラムの劣化
Voided
column.
カラム内に空隙が生成
Contaminated
solvents.
移動相溶媒の汚染
Wrongly
wired detector.
信号ケーブル接続間違い
All brands and products are trademarks of their respective companies.
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181
Technical Information
HPLCトラブルシューティング
Symptom
Cause
Action
Flat topped Peaks
台形状のピーク
Detector
overload.
検出器オーバーロード
Reduce
the sample concentration.
試料濃度を減らす
Tailing Peaks
Old
guard cartridge.
ガードカラム劣化
Replace
the guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換
Injection
volume too high.
試料注入量が多過ぎる
Reduce the injection volume to avoid overload. Typically injection volumes of < 40% of the expected peak
オーバーロードにならない様、試料注入量を減らす。一般にピーク幅の40%以下の注入量とする。
width should be used.
Injected
mass too high.
試料量が多過ぎる
オーバーロードとならない様、試料濃度を減らす
Reduce
the sample concentration to avoid mass overload.
Old column.
Do
not use columns that have been used with ion-pair reagents for reversed phase methods.
イオンペアクロマトに使用したカラムは他の逆相LC分析に使用しない。性能劣化したカラムは交換する
Old columns give much lower efficiencies than new column. Replace the column if necessary.
ピーク形状関連
Peak Shape Problems
テーリングピーク
Detector
set-up.
検出器の設定間違い
Injection
solvent too strong.
試料溶解溶媒の極性が高過ぎる
カラムの劣化
Contaminated
column.
カラムの汚染
Fronting Peaks
フロンティングピーク
Voided
column.
カラムに空隙
Old
or damaged column.
カラム劣化・悪化
ピークの大きさと保持関連
Peak
Size and Retention Problems
Small Peaks
ピークが小さい
Ensure
that the injection solvent is the same or weaker strength than the mobile phase.
試料溶解溶媒の極性は、移動相と同じか、それより低いものを使用する
Wash
the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
Replace
the column. Do not use outside the recommended pH range.
カラムを取り替える。カラムは推奨pH範囲内で使用する
Replace
the column.
カラムを新品に交換する
Degraded
sample.
試料劣化
Inject
a fresh sample.
新しく試料溶液を作り直す
Detector
set-up.
検出器設定不良
Check
the detector attenuation and re-zero.
アテニュエータの設定を確認し、シグナルをゼロにする
Low
analyte concentration.
試料濃度が低過ぎる
No
wash solvent.
洗浄溶媒がない
Damaged
or blocked syringe.
シリンジ不良・詰まり
Incorrect
amount injected.
注入量が正確でない
No Peaks
ピークが出ない
Check
the detector attenuation and re-zero.
アテニュエータの設定を確認し、シグナルをゼロにする
Increase
the analyte concentration.
試料濃度を増やす
Check that the solvent wash reservoir is filled with a miscible solvent and that the injector is set to wash
移動相と混ざる洗浄溶媒がリザーバに入っているか、試料注入後、洗浄されているかチェックする
between injections.
Replace
the syringe.
新しいシリンジに取り替える
Check
injector loop size and that no more than 50% of this volume is used for partial loop injections.
インジェクタループサイズをチェックする(部分注入はループ容積の半分以下であること)
Viscous
injection solvent.
溶解溶媒の粘度が高い
Reduce
syringe draw-time.
シリンジ引抜時間を短くする
Sample
vial empty.
バイアルに試料がない
Fill
sample vial.
バイアルに試料を入れる
Old
detector lamp.
検出器光源の劣化
Leak
in system.
系内に漏れ
Replace
the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours.
光源ランプの交換(特に、使用時間が2000時間を越える場合)
Check
for and replace any leaking tubing or fittings.
配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する
being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly.
溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる。一定組成であれば、
ポンプ溶媒ミキシング不良 Where
移動相を作成してみる。
Pump not mixing solvents properly.
Damaged
or blocked syringe.
シリンジ不良・詰まり
Different dwell volume.
Old
detector lamp.
検出器光源の劣化
Missing Peaks
ピークが行方不明
Degraded
sample.
試料劣化
Immiscible
mobile phase.
不混和移動相
Fluctuations
in pH.
移動相pHの変動
Extra Peaks
Degraded
sample.
試料劣化
余分なピークが現れる
Replace
the syringe.
新しいシリンジに交換する
For gradient methods, check that the dwell volume of any new system is not very different from any
previous system. Apply a final hold time if necessary.
Replace
the lamp, particularly when this has been in use for > 2000 hours.
光源ランプの交換(特に、使用時間が2000時間を越える場合)
Inject
a fresh sample.
新たに試料を調製し直す
Check
that any solvent already in the column is miscible with the mobile phase.
カラム内の前の移動相と新しい移動相とが混ざるかチェックする。必要な場合は、
i-PrOHまたはEtOHを流してみる。
Flush
with propan-2-ol or ethanol where necessary.
Buffer
the mobile phase so that retention of ionizable compounds is controlled.
イオン性成分の保持時間を一定に抑えるよう、移動相に緩衝液を加える
Inject
a fresh sample.
新たに試料を調製し直す
Contaminated
solvents.
溶媒の汚染
HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る。グラジエント溶出では、しばしば、ゴーストピークが現れる。
Use
freshly prepared solvents of HPLC grade. Gradient methods often show ‘ghost-peaks’.
Fluctuations
in pH.
移動相pHの変動
Buffer
the mobile phase so that retention of ionizable compounds is controlled.
イオン性成分の保持時間を一定に抑えるよう、移動相に緩衝液を加える
Immiscible
mobile phase.
不混和移動相
Contaminated
guard cartridge.
ガードカラム劣化
Varying Retention
保持時間が変化する
If the method is isocratic, blend the solvents manually.
Check
that any solvent already in the column is miscible with the mobile phase.
カラム内の前の移動相と新しい移動相とが混ざるかチェックする。必要な場合は、
i-PrOHまたはEtOHを流してみる。
Flush
with propan-2-ol or ethanol where necessary.
Replace
the guard cartridge.
ガードカートリッジカラムを交換
Contaminated
column.
カラムに汚染
Wash
the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem , replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
Leak
in system.
系内に漏れ
Check
for and replace any leaking tubing or fittings.
配管接続部からの漏れの有無をチェック、交換する
Contaminated
column.
カラムの劣化
Wash
the column using an appropriate solvent. If this does not resolve the problem, replace the column.
適切な溶媒でカラムを洗浄。駄目な場合は、新品に取り替える
System
not equilibrated.
Equilibrate
the column with 10 volumes of mobile phase.
カラム平衡化できていない
カラム容積の10倍量の移動相で平衡化する
Temperature
fluctuations.
温度変動に起因
Use
a thermostatically controlled column oven.
カラムオーブンを温調する
Ultrasonicate
the reservoir frits in water and then methanol.
リザーバーの焼結フィルタ(フリット)を水、次にMeOHを用いて、超音波洗浄する
being used, ensure that the proportioning valve is mixing the solvents correctly.
溶媒ミキシングが正しくできているか、プロポーショニングバルブを調べる。一定組成であれば、
ポンプ溶媒ミキシング不良 Where
移動相を作成してみる。
Blocked
solvent reservoir frits.
リザーバ焼結フィルタ閉塞
Pump not mixing solvents properly.
If the method is isocratic, blend the solvents manually.
Contaminated
solvents.
溶媒の汚染
Use
freshly prepared solvents of HPLC grade.
HPLCグレードの溶媒で新しく移動相を作る
Different dwell volume.
For gradient methods, check that the dwell volume of any new system is not very different from any
previous system. Apply a final hold time if necessary.
Piston
seals leaking.
ピストンシールの漏れ
Air
in solvent lines or pump.
溶媒ラインorポンプに気泡混入
Check
for evidence of leaking or wear and replace where necessary.
漏れ、磨耗の有無をチェックし、必要に応じ、取り替える
Ensure
that the reservoirs and solvent lines are fully primed and that the purge valve is fully closed.
リザーバーからの気泡混入の有無、パージバルブ゙が開いていないかチェックする
For more information, please request Successful HPLC Operation – A Troubleshooting Guide, TG20094.
All brands and products are trademarks of their respective companies.
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181
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202
202 - 203
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204 - 205
分析スケールを小さくする/分析スケールを大きくする
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206 - 207
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207
移動相溶液の調製法
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208
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209
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210
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( 203ページのバンドスプレッディングテストを参照下さい)
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1. 䉦䊤䊛䈱ធ⛯䈱ะ䈐䉕෻ኻ䈮䈜䉎
䈲䇮䉦䊤䊛ኈⓍ䈱40-60୚㊂䉕ᗧ๧䈜䉎䉅䈱䈫䈚䉁䈜䇯㩷
2.㩷 0.1%䈱TFA(䍢䍶䍪䍷䍓䍹㈶㉄)䉕฽䉃50ml䈱
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3.㩷 0.1%䈱TEA(䍢䍶䍒䍟䍷䍏䍮䍻)䉕฽䉃50ml䈱THF:᳓(1:1)
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4. 0.1%䈱TFA(䍢䍶䍪䍷䍓䍹㈶㉄)䉕฽䉃50ml䈱
䈚䈩䈒䈣䈘䈇䇯ᵞᵺᓟ䈮㑐䈚䈩䈲䇮ᦨᓟ䈮ᵞᵺ䈮૶↪䈚䈢ṁᇦ
THF:᳓(1:1)䈪ᵞᵺ
䈏䇮ᕈ⢻⹜㛎↪䈱⒖േ⋧ṁᇦ䈫ᷙ䈙䉍ว䈉䉅䈱䈪䈅䉎䈖䈫䉕㩷
⏕⹺䈚䈩䈒䈣䈘䈇䇯㩷
5. THF(䍡䍢䍵䍩䍢䍼䍹䍪䍵䍻)70ml䈪ᵞᵺ
㩷
6.㩷 MeOH:᳓(95:5)䉕ᵹ䈚䈩䉦䊤䊛䉕ౣᐔⴧൻ
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1.㩷 THF䋨䊁䊃䊤䊍䊄䊨䊐䊤䊮䋩ᵞᵺ
7.㩷 䉦䊤䊛䈱ะ䈐䉕ర䈮ᚯ䈜䇯
2.㩷 MeOH䋨䊜䉺䊉䊷䊦䋩ᵞᵺ
ᒝ䈇᦭ᯏṁᇦ䈪䈱ᵞᵺ䈮䉋䉎Hypercarb䉦䊤䊛ౣ↢
3.㩷 THF䋨䊁䊃䊤䊍䊄䊨䊐䊤䊮䋩ᵞᵺ
ᭂᕈ/䉟䉥䊮ᕈ⹜ᢱ䉕᳓䉕฽䉃⒖േ⋧䈪ಽᨆ䈚䈢႐ว䈮
4.㩷 CH2C䌬2䋨䉳䉪䊨䊦䊜䉺䊮䋩ᵞᵺ
ㆡ䈚䉁䈜䇯
5.㩷 䊔䊮䉷䊮䉕ో䈒฽䉁䈭䈇䊓䉨䉰䊮䈪ᵞᵺ
1.㩷 50ml䈱䉝䉶䊃䊮䈪ᵞᵺ
ㅒ⋧䉦䊤䊛䈱႐ว 㩷
1.㩷 HPLC↪䈱⿥⚐᳓䈪ᵞᵺ䇯䈠䈱ᵞᵺ䈱㓙䈮䇮DMSO
2.㩷 120ml䈱䉳䊑䉼䊦䉣䊷䊁䊦䈪ᵞᵺ
㩷 㩷 䋨䉳䊜䉼䊦䉴䊦䊖䉨䉲䊄䋩200ȝl䉕4࿁ᵈ౉䈜䉎
4.㩷 ᳓䉕฽䉃⒖േ⋧䈪䉦䊤䊛䉕ౣᐔⴧൻ㩷
2.㩷 MeOH䋨䊜䉺䊉䊷䊦䋩ᵞᵺ
㗅⋧䈪૶↪䈚䈩䈇䈢႐ว䈪䈱Hypercarb䉦䊤䊛ౣ↢
3.㩷 CHCl3䋨䉪䊨䊨䊖䊦䊛䋩ᵞᵺ
㗅⋧䈪ਥ䈮૶↪䈚䈩䈇䈢႐ว䈮ㆡ䈚䉁䈜䇯㩷
4.㩷 MeOH䋨䊜䉺䊉䊷䊦䋩ᵞᵺ
1. 50ml䈱DCM(䍚䍼䍖䍹䍹䍰䍞䍻)䈪ᵞᵺ㩷
㒶䉟䉥䊮੤឵䉦䊤䊛䈱႐ว㩷
1.㩷 HPLC↪䈱⿥⚐᳓䈪ᵞᵺ䇯㩷
㪉㪅㩷50ml䈱MeOH(䍰䍞䍧䍎䍷)䈪ᵞᵺ㩷
2.㩷 50mM䈎䉌1MỚᐲ䈱ㆡಾ䈭✭ⴣᶧ䋨䉫䊤䉳䉣䊮䊃䋩
4. 50ml䈱0.1M HCl䈪ᵞᵺ
Author: R. Plumb – Glaxo, UK
3.㩷 50ml䈱䉝䉶䊃䊮䈪ᵞᵺ
3.㩷50ml䈱᳓䈪ᵞᵺ㩷
5. 50ml䈱᳓䈪ᵞᵺ㩷
䈪ᵞᵺ㩷
3.㩷 HPLC↪䈱⿥⚐᳓䈪ᵞᵺ䇯㩷
6. 50ml䈱MeOH(䍰䍞䍧䍎䍷)䈪ᵞᵺ㩷
4.㩷 MeOH䋨䊜䉺䊉䊷䊦䋩ᵞᵺ㩷
7. 50ml䈱DCM(䍚䍼䍖䍹䍹䍰䍞䍻)䈪ᵞᵺ㩷
5.㩷 CHCl3䋨䉪䊨䊨䊖䊦䊛䋩ᵞᵺ
8. ૶↪䈚䈩䈇䉎⒖േ⋧䉕ᵹ䈚䇮䉦䊤䊛䉕ౣᐔⴧൻ
㓁䉟䉥䊮੤឵䉦䊤䊛䈱႐ว 㩷
1.㩷 HPLC↪䈱⿥⚐᳓䈪ᵞᵺ䇯䈠䈱ᵞᵺ䈱㓙䈮䇮DMSO
Author: A. Karlsson – Uppsala, Sweden㩷
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㩷 㩷 䋨䉳䊜䉼䊦䉴䊦䊖䉨䉲䊄䋩200ȝl䉕4࿁ᵈ౉䈜䉎㩷
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2.㩷 THF䋨䊁䊃䊤䊍䊄䊨䊐䊤䊮䋩ᵞᵺ㩷
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Ⱞ⊕⾰䈱䉰䉟䉵ឃ㒰䉪䊨䊙䊃䈱႐ว䇮એਅ䈮␜䈜
䉦䊤䊛䈱ౣ↢䉕ⴕ䈦䈩䇮Hypercarb䉦䊤䊛䈏ㆬᛯᕈ෸䈶
2䈧䈱ᣇᴺ䈪䉦䊤䊛ᳪᨴ‛⾰䉕ข䉍㒰䈒䈏䈪䈐䉎䇯
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1. TFA䉕㒰෰䈜䉎䈮䈲䇮
1.㩷 0.1M pH 3.0䈱䊥䊮㉄✭ⴣᶧ30ml䈪ᵞᵺ
㩷 㩷 THF(䍡䍢䍵䍩䍢䍼䍹䍪䍵䍻)䉕䉦䊤䊛ኈ㊂䈱70୚㊂ᵹ䈜䇯
ᒝ䈒଻ᜬ䈘䉏䈩䈇䉎Ⱞ⊕⾰䈱႐ว
2.㩷 DEA㩿䍚䍼䍒䍟䍷䍏䍮䍻㪀䉕㒰෰䈜䉎䈮䈲
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1.㩷 100%᳓ĺ100%CH3CN䈱䉫䊤䉳䉣䊮䊃60ಽ䈪
CH3CN (䍏䍜䍢䍤䍢䍶䍷)䉕䉦䊤䊛ኈ㊂䈱120୚㊂ᵹ䈜䇯
㩷 㩷 ᵞᵺ
200
㪉㪇㪇
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Column Type
Metal Contamination
Organic
Column Cleaning
Contamination
Pump in reverse flow mode
Pump in reverse flow mode
Hydrogen
at 0.1 mL/min with 0.1M
at 0.1 mL/min with 20:80
Counter Ion
H2SO4
ACN: 0.01M [email protected] 65 °C for 4 hr
@ 25 °C for 4 to 16 hr
Pump in reverse flow mode
Calcium
at 0.1 mL/min with 0.1M
Ca(NO3)2
Pump in reverse flow
@ pH 6.3 and 85 °C for 4 to 16
mode
hr
at 0.1 mL/min with
Pump in reverse flow mode
20:80
Sodium
at 0.1 mL/min with 0.1M
ACN: H2O @ 25 °C
Counter Ion
NaNO3
for 4 hr
Counter Ion
@ 85 °C for 4 to 16 hr
Pump in reverse flow mode
Lead Counter
Ion
at 0.1 mL/min with 0.1M
Pb(NO3)2
@ pH 5.3 and 85 °C for 4 to 16
hr
㪉㪇㪈
201
Pump in reverse flow mode
at 0.1 mL/min with 20:80
ACN:H2O @ 25 °C for 4 hr
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㨗㧦 㩕㩩㨺㩂 ߩ଻ᜬ⢻
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8㧦 㩕㩩㨺㩂 ߩ଻ᜬኈ㊂㧔଻ᜬᤨ㑆㧕
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4ǻᴺ㧔W㧦13.4㧑㧕
N㧩16 (T/W)2
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N㧩5.54 (T/W)2
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6㧩9㧛㨒 9㧦ࡇ࡯ࠢߩ ߩ㜞ߐߩ᏷
㨒㧦ࡇ࡯ࠢ㜞ߐߩ 㧑ߩ૏⟎㧔೨㧕߆ࠄု✢߹ߢߩ᏷
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ᬌ಴ེߩᗵᐲ 㧦 㧙#7(5
ᬌ಴ེߩᤨቯᢙ㧦 ޽ࠆ޿ߪߘࠇએਅ
㩋㨶㨺㩎㩇㩕㩩㨺㩎㩨 㧦 EOOKP
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OO
ኈ㊂
Ǵ.EO
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ㅢᏱߩ HPLC 100r30ǴL
ኈ㊂
㈩▤ౝᓘ
+PEJ
Ǵ.KPEJ
20
㪉㪇㪊 203
HPLC and LC/MS
分析スケールを小さくする
Scaling Down a Method
HPLCあるいはLC/MSでのスケール
Reasons to Scale Down a HPLC or
ダウンが必要となる理由
LC/MS Method
There are applications where it is desirable to
scale down a method without transferring the
method to U-HPLC. These reasons may be to:
試料量が少ないので、感度の増加が
• Maximize
sensitivity when small amounts
必要とされる
of
sample are available
• Make
flow rate compatible with ionization
ESIイオン化によるMS検出を行うた
め、流速を下げる必要がある
technique
in MS detection
溶媒消費量を減らし、コスト低減を
• Reduce
costs by reducing solvent
図りたい
consumption
Transfer
Method to a
内径の細いカラムへの
分析法の変更
Narrower
Column
UV検出からMS検出に変える場合あるいは
Reducing the scale of a separation by reducing
ドラッグディスカバリーやプロテオミクス
the column internal diameter may be necesなどのように、試料絶対量が少ない場合に
sary when transferring a method from UV
は、カラム内径を小さくして、分離のス
to MS detection, or when only very small
ケールを下げる必要があります。MS検出
amounts of sample are available, such as in
に変える場合は、イオン化手法あるいはイ
オン源デザインにより、最適な流量範囲が
drug discovery or proteomics. In the first
決まります。(上の表を参照してくださ
case ionization technique or source design
い)試料量が限られていて少ない場合は、
determines the best flow rate range (see table
高濃度で検出できるように、クロマト上の
above) and in the latter case, method sensiピーク幅を出来るだけ狭くすることが求め
られます。もし、他の条件、カラム長さ、
tivity is maximized because solutes elute in
充填剤粒子径、充填剤種類、移動相組成、
more concentrated chromatographic bands.
グラジエント条件、カラム温度などが同じ
If all other method parameters (column
場合は、内径を細くすることで、変更が求
length and particle size, column chemistry,
められるのは、流速のみを次式で計算され
mobile phase composition, gradient range
る値に変更する必要があります。
and time, separation temperature) are kept
unchanged, the change to a narrower column
only requires adjustment of the flow rate.
F2 = F1 x (dc2 /dc1)2
where
F1 – original flow rate (to be reduced)
F2 – new flow rate
dc1 – original column internal diameter
dc2 – new column internal diameter
その理由としては、カラム容積が変わるか
This is applicable to both isocratic and
らです。流速は、移動相条件が一定であっ
gradient methods. The new method should
ても、グラジエントであっても同じです。
produce a chromatogram with identical
流速が新しい値になっても、原則的に分離
resolution and identical run time. If small
度、分析時間は変わりません。もし、保持
changes in retention times and resolution
時間や分離度が変わるとすると、それは、
後述のシステムドウエル容積(system
are observed this is generally caused bydwell
volume)が変化することによるものです。
Typical Flow Rates for Analytical, Narrowbore, Capillary and
Nanobore Columns (5 µm Particles)
Column ID
(mm)
Flow Rate Range
(µL/min)
Optimum Flow
Rate1 (µL/min)
Recommended
Injection Volume2 (µL)
API
Source
4.6
1000 – 1500
1250
30
APCI or High flow ESI
3.0
400 – 600
500
10
APCI or High flow ESI
2.1
200 – 300
250
5
APCI or Micro-ESI
1.0
40 – 60
50
1
Micro-ESI
0.5
10 – 25
12
0.35
Micro-ESI
0.32
4 – 10
5
0.15
Micro-ESI
0.18
1–3
2
0.05
Micro-ESI
0.1
0.4 – 1
0.5
0.015
Nanospray
0.075
0.2 – 0.5
0.3
0.01
Nanospray
1. Recommended for good efficiency and moderate pressure. Higher flow rates may lead to column voids. Lower flow
rates are recommended for washing column bed or changing solvents.
2. Estimates based on negligible loss of efficiency and isocratic elution with sample solvent identical to mobile phase.
Larger volumes can be introduced under gradient conditions or using weaker sample solvent.
短いカラム長さへの変更
Transfer Method to a Shorter Column
グラジエント条件を使用している場
In gradient elution, the simplest way to
合、分析サイクル時間を短縮する最も
reduce the method cycle time is to reduce
単純な方法は、カラム長さを短くする
the column length. If all other method
ことです。もし、他の条件−カラム内
parameters (column ID and particle size, col径、粒子径、充填剤種類、移動相組
umn chemistry, mobile phase composition,
成、グラジエント条件、流速、カラム
温度−が変わらなければ、グラジエン
gradient range, flow rate, separation temperトの時間のみ、式Bに従って変更しま
ature) are kept unchanged the only requireす。グラジエント時間は、カラム容積
ment is to change the gradient time using
の比だけ減少することになります。
the equation below, where gradient time is
reduced by the same factor as the
reduction in column volume.
tg1/Vc1= tg2 /Vc2
where tg1 – gradient time in original
method (min)
tg2 – gradient time in new method (min)
Vc1 – original column volume (mL)
Vc2 – new column volume (mL)
Column volume Vc (mL) can be estimated using:
Vc = 0.68 x π x r2 x L
Vc – column volume (mL);
L – column length (cm);
r – column radius (cm)
system dwell volume (discussed below).
㪉㪇㪋
210
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204
ドウェル容積
Dwell Volume
Dwell Volumeとは、移動相が混合される点か
Dwell volume is just as important when scaling
らカラムヘッドまでのHPLCシステムの容量
のことです。別の言い方をするとグラジエン
down a method as for method transfer to
ト分析における、移動相が一定組成のまま遅
U-HPLC. The effect of dwell volume on the
れる、その容量を意味します。汎用のHPLC
separation is more significant when narrow
においては、その容量は、0.5-5mLの範囲で
columns are used
at low flow rates. For
す。このdwell
volumeが分離に影響するの
instance, if the system has a dwell volume
は、低い流量を流す内径の細いカラムを用い
る場合です。dwell
volumeが2mLを持つ
of 2.0 mL and a 4.6 mm
ID column is run at
HPLCで考えると、通常の4.6mmφのカラム
1 mL/min, it takes 2 minutes for the gradient
で流速1mL/分の場合、グラジエント開始の
to reach the head of the column; however,
2分後に、カラム先端にグラジエント移動相
if a 2.1 mm ID column is used with a
が到達します。しかしながら、2.1mmφのカ
ラムで流速が0.4mL/分の場合、グラジエント
0.4 mL/min flow rate it will take 5 minutes
の遅れの時間は5分にもなります。従って、
for the gradient to reach the column. In high
内径の細いカラムにより、ハイスループット
throughput gradient separations using small
分析を行う際、dwell volumeが大きいと分析
volume
columns, dwell volume causes an
時間や、分析終了後、次の試料を分析するた
increase in run times and longer re-equilibraめ、グラジエント条件の初期値に戻したりす
る、再平衡化時間が長くなってしまいます。
tion time between runs.
グラジエント条件の遅れを極力減らす為に、
Several approaches can be taken to
幾つかの方法があります。
minimize these effects:
• 小さなグラジエントディレイ容量を持
Select a pump with a small gradient delay
つHPLCを使用する(Accela
volume (e.g., Thermo Scientific ポンプは、
Accela high
僅か65μLです)。
speed LC system has a delay volume of
only 65 µL);
グラジエントがカラム先端に達した時
• Delay
sample injection until gradient has
に、遅れて試料を注入する
reached the head of the column;
高流量でHPLCを運転し、移動相はスプ
• Set the pump at a higher flow rate and
リットさせ、一部をカラムに流すよう
split
the flow before the column.
に工夫する
Technical Information
分析スケールを大きくする
Scaling Up a Method
HPLCあるいはLC/MSでのスケール
Reasons to Scale Up an
アップが必要となる理由
HPLC Method
分析法のキャパシティを大きくしたい
• Increase
method capacity
ターゲット化合物の単離精製目的
• Isolation
and purification of target
compounds
試料のスループットを上げたい
• Increase
sample throughput
混合物試料から目的の成分を単離精製が
Analytical methods may require scale up
必要になる場合、分析法のスケールアッ
to preparative sizes to isolate and purify
プが必要となります。分取を行うに当た
compounds from mixtures. In choosing the
り、最良のカラムあるいは充填剤を選択
best column and packing material for your
する際、カラムサイズの他にカラムの分
離選択性や試料負荷量についても考慮
preparative application, consider the selecし、最も早くて安く行えるようにする必
tivity and loadability of the media as well as
要があります。サーモフィッシャーは、
column dimensions, to give the results you
Hypersilカラムなどの分析用カラムと同
need most quickly or economically. We have
様の分離性能・再現性を有する分取用カ
established a strong reputation for the manuラム、充填剤も提供いたしております。
スケールアップは、分析用に用いた充填
facture and supply of high quality preparative
剤と同一の充填剤(但し、粒子径は大き
silicas and bonded phases, designed to give
め)を用いるのが最も簡単です。 弊社
the same levels of performance and reproは、分取用カラムとして、分析用カラム
ducibility as our popular analytical silica
と同じ充填剤で粒子径が大きい充填剤を
ranges such as the Hypersil™ phases.
各種用意いたしております。分取検討用
カラムに、250mm×4.6mmの検討カラ
Scale up is easiest when starting from
ムが通常、用いられます。分析用カラム
an analytical column packed with smaller
の分析条件が決まれば、スケールアップ
particle size media offering the same selecができます。
tivity as the larger particle size preparative
media. The leading families of Thermo
Scientific phases are offered in various sizes
to complement lab scale operations and
facilitate the scale up to preparative
chromatography. Scout columns, typically
250 x 4.6 mm packed with the media of
interest can also be used to develop the
separation. Once the method is finalized
on the smaller column, a scaling factor
can be applied.
Mobile phase viscosity changes with composition
分取LCの為のスケールアップ法
Scaling
Up to a Preparative Column
カラム背圧(バックプレッシャー)
Column Backpressure
Flow
rate and column load scaling are only
カラムの内径を大きくした場合に変更が
必要になるのは、流速および試料負荷量
required
when changing the internal diameter
ofです。スケールファクターとは、内径が
the column. The scaling of flow rates allows
異なる場合でも、保持時間
peak
retention times to remain relatively
を一定に保つためのものです。移動相の
constant
between columns with different
流速の典型的な値は、カラム内径と充填
internal
diameters. The typical solvent flow
剤粒子径で決まります。このスケール
ファクターは、カラムの試料負荷量の計
rate
through a column is dependent on its
算にも使用できます。カラム長さが同じ
internal
diameter and the particle size of the
場合、スケールファクターは、次式で計
column
packing
material. This scaling factor
算されます。
can
also
be
used
to estimate the loading
カラムへの試料負荷量も、このスケーリ
capacity
of a given column. Assuming column
ングファクターで計算できます。
length is a constant, the scale factor can be
calculated using the following formula:
カラム背圧は、カラム長さ、内径、充填
Column operating backpressure is affected
剤粒子径、温度、溶媒、流速により、影
by column length, internal diameter, media
響されます。さらには、グラジエント条
particle size, temperature, solvent properties
件−移動相組成比にも影響を受けます。
and solvent flow rate. It can also be affected
カラム背圧は、一般に次式であらわされ
by the use of gradients, where the pressure
ます。移動相の粘度は、組成比により変
わります。メタノール、アセトニトリル
may vary with solvent composition. Typical
を水に加えた場合の粘度の変化の例を上
operating backpressure for columns or
の図に示します。LC装置で最大のス
cartridges can be calculated using the
ループットを得るには、移動相の粘度変
following equation:
化も重要になります。
Scale Factor = dc22/dc12
where
and
dc1 – original column internal
diameter (mm)
dc2 – new column internal
diameter (mm)
The column loading capacity and flow
rate required for the new larger ID columns
can be calculated using this factor.
Pressure (atm) = 2.1 x Φ x L x η
dp2 x d2
where Φ = column impedance
(1000 for 4.6 mm ID columns)
L = column length (mm)
dp = particle diameter (µm)
d = column diameter (mm)
η = mobile phase viscosity
(centipoises)
The mobile phase viscosity varies with
composition. As an example, the figure
above shows how water viscosity varies
with the addition of methanol or acetonitrile.
This variability is a critical component in
maximizing throughput with respect to the
chromatography instrumentation being used.
㪉㪇㪌
www.thermo.com /columns
205
211
HPLC and LC/MS
緩衝液の正しい選択法
Selecting the Right Buffer
右の表は、よく使われる緩衝液とそのpH
A partial list of common buffers and their
につきまとめたものです。HPLCで最も良
corresponding pH values is shown in the
く用いられる緩衝液はリン酸緩衝液です。
Common Buffer Systems table. Perhaps the
緩衝液とは、PH変化に対し抵抗する能力
most common HPLC buffer is some form of
を持つものです。しかし、緩衝液の緩衝能
phosphoric acid. Remember that a true buffer
を100%発揮するのは、そのpK値のみで
す。例えば、リン酸緩衝液は、pH4では、
should have the ability to resist pH change
緩衝能は十分には働きません。酸あるいは
when a sample is introduced at a different pH,
塩基性の試料を加えると、pHはpKa値に向
and that buffer capacity is only 100% at the pK
かって変化します。以上より、一般に緩衝
value of the acid or base. At pH 4, phosphate
液を使用する場合は、制御可能な移動相の
pH範囲は、緩衝液のpKa±1の範囲となり
is a poor buffer and would change rapidly
ます。必要な緩衝液濃度はカラム充填剤や
toward one of its pKa values if a more acidic
試料濃度や試料の性質などに依存します
or basic sample were introduced.
が、10-100mMの濃度を用います。
As aGOLD
rule, one
should work within ±1 pH
Hypersil
aQカラムなどのは、通常のア
unit of the buffer pKa value for good pH
ルキルシリカカラムに比べ、緩衝液濃度は
薄くてすみます。
control of the mobile phase. Adequate buffer
concentrations for HPLC tend to be in the
移動相pHを2-3に制御したい場合には、リ
ン酸緩衝液あるいはTFA、ギ酸などのより
10 - 100 millimolar level depending on the
強い有機酸が一般的に用いられる。移動相
size and nature of the sample, as well as the
pHを4-5に制御したい時は、リン酸塩の代
column packing material. Phases based on
わりに酢酸塩やクエン酸塩などの有機酸塩
highly pure silica with robust bondings such
緩衝液を用います。右の図は、適切な移動
相pHを選ぶことが分離に大事なことを示
as the Hypersil GOLD range, are often more
すものである。適切な緩衝液を使用してい
compatible with dilute buffers than
ないと、様々な要因(移動相調製誤差、ポ
traditional packings.
ンプミキシング変動、大気からの水分の移
When control at a lower pH (2 - 3) is
動相への吸着)により、移動相pHが幾分
desired, phosphate, or stronger organic acids
変化することになります。緩衝液と有機移
動相は混合した場合、塩が析出することが
such as TFA or acetic acid, are commonly
あるので、注意が必要です。分析終了後
used. If control at pH 4 - 5 is desired, an
は、いつも洗浄を行い、焼結フィルタ(フ
organic acid buffer such as acetate or citrate
リット)に固体を析出させない様にして下
should be considered in place of phosphate.
さい。
The figure to the right shows the
importance of choosing the correct pH for a
separation. Even slight changes in pH, either
from measuring errors, mixing complications
with the pump, or atmospheric water
adsorption into the mobile phase, can alter
any method if not properly buffered.
Care should be taken when choosing a
buffer and organic modifier mixture to ensure
that a solution of the two does not produce
a solid salt which could cause blockages and
system contamination.
Buffers should always be flushed from
the analytical column and instrument after
use to avoid salts being deposited on delicate
frits etc.
Common Buffer Systems
Buffer
pKa
TFA
0.30
Phosphate
MS-Compatible?
Yes
pK1
2.1
1.1 – 3.1
No
pK2
7.2
6.2 – 8.2
No
pK3
12.3
11.3 – 13.3
No
pK1
3.1
2.1 – 4.1
No
pK2
4.7
3.7 – 5.7
No
pK3
5.4
4.4 – 6.4
No
Formate
3.8
4.4 – 6.4
Yes
Acetate
4.8
3.8 – 5.8
Yes
Tris Base (Trizma, THAM)
8.3
7.3 – 9.3
Yes
Ammonia
9.2
8.2 – 10.2
Yes
Borate
9.2
8.2 – 10.2
No
Diethylamine
10.5
9.5 – 11.5
Yes
Citrate
Carbonate
pK1
6.4
5.4 – 7.4
Yes
pK2
10.3
9.3 – 11.3
Yes
Triethanolamine
7.80
Yes
BETASIL™ C18, 5 µm, 50 x 4.6 mm
Part Number: 70105-054630
Eluent:
50% ACN / 50% 25 mM KH3PO4
at pH indicated
Flow Rate: 0.8 mL/min
Detector:
UV @ 220nm
A: pH 2.1
Sample:
1. Uracil
2. Tolmetin
3. Naproxin
4. Fenoprofen
2 3
1
7
7
1
4
4 5
5
6
6
701-085
0
6 MIN
701-086
0
Effect of small changes in pH on the separation of mildly ionizable compounds
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206
5. Diflunisal
6. Indometacin
7. Ibruprofen
B: pH 2.5
2 3
㪉㪇㪍
216
Useful pH Range
6 MIN
Technical Information
LC/MS用緩衝液の選択
Buffer Selection
for LC/MS
緩衝液の選択は、試料及び分析装置に依
Buffer choice will be very dependent on the
存します。理想的には、LC/MSを行う場
analyte and the instrumentation used. Ideally,
合、イオン源を汚染する固体析出がな
LC/MS applications should use a volatile
い、揮発性の緩衝液を用います。無機
buffer as this will not form a contaminating
酸、不揮発性緩衝液やイオン対試薬など
の使用は避けて下さい。典型的なLC/MS
deposit on the source. Inorganic acids,
用緩衝液は以下の通りです。
involatile buffers and ion-pair reagents should
all be avoided. Typical LC/MS buffers include:
• Ammonium acetate/formate/hydrogen
carbonate (< 50 mM)
• Formic/acetic acid (0.01 – 1% v/v)
• Trifluoroacetic acid (< 0.1% v/v)
• Trialkylamine (< 0.1% v/v) and aqueous
ammonia type bases
• TRIS
• BIS-TRIS propane
Note: There are LC/MS instruments available, for
example the Surveyor™ MSQ™ LC/MS, which incorporate
a self-cleaning mechanism to reduce the build up
of inorganic buffers on the source during routine use.
Care should still be taken not to purposefully overcontaminate the instrument source as this will lead to
operating difficulties.
移動相溶液の調製法
Preparation of Mobile Phases
正しく移動相を調製することは大事なこと
Correct solvent preparation is very
です。その理由は調整法を誤ると、種々の
important. It can save vast amounts of
トラブル、偽のピーク、ベースラインの変
time spent troubleshooting spurious
動を引き起こし、貴重な時間を無駄に費や
peaks, baseline noise etc.
すことになるからです。
Quality
All reagents and solvents should be of the
全て、LCで用いる試薬および溶媒は最高の
品質のものを使用して下さい。HPLCグレー
highest quality. HPLC grade reagents may
ドの試薬は値段が少し高くなりますが、純
cost slightly more than lower grade
度の違いに注意を払う必要があります。
reagents, but the difference in purity is
HPLCグレードには含まれませんが、純度の
marked. HPLC grade reagents contain no
低い試薬は、含有不純物によるゴースト
ピークを生じさせます。また、緩衝液を調
impurities to produce spurious peaks in a
製時に使用する水についても、高純度のも
chromatogram baseline whereas lower
のを使う必要があります。脱イオン水は、
grade reagents do contain trace levels of
極微量の有機物を含みますので、それを使
impurities, which may produce spurious
用することは薦められません。
baseline peaks.
緩衝液の調製には、高純度の水を使用する
Ensure that any water used in buffer
必要があります。脱イオンだけでは、ト
preparation is of the highest purity.
レースレベルの有機物が含まれるので、
Deionized water often contains trace levels
HPLC用には勧められません。
of organic compounds and therefore is not
HPLC用の超純水(18MΩ)は、脱イオン水を
イオン交換樹脂を通すことで製造されま
recommended for HPLC use. Ultra pure HPLC
す。市販の超純水製造装置は、このメカニ
water (18 MΩ resistivity) is generated by
ズムで大量の超純水を製造するものです。
passing deionized water through an ion
または、試薬メーカーから、HPLC用の水を
exchange bed. Modern water purification
購入することもできます。
instruments use this mechanism to produce
water of suitable quality in high volumes.
Preferably, HPLC grade water can be
purchased from solvent suppliers.
Important: Do not store HPLC grade water in plastic
containers. Additives in the plastic may leach into the
water and contaminate it. Always store HPLC grade
water in glass containers.
Buffers
全ての緩衝液は、用事調製して下さい。そ
All buffers should be prepared freshly on the
れは、長期保存により、pH変化や微生物
day required. This practice ensures that the
(菌)の発生が起きることがあるからで
buffer pH is unaffected by prolonged storage
す。これらは、分離の妨げになります。
and that there is no microbial growth present.
Changes in pH and microbial growth will
affect chromatography.
Mobile Phase – Not Degassed
Mobile Phase – Degassed
緩衝液を貯蔵する場合には有効期間があ
If buffer solutions are stored, be aware
ることを理解してください。緩衝液の有
that they have a finite lifetime. Refer to
効期限などは、薬局方などの解説を参照
pharmacopoeia monographs or similar for
下さい。緩衝剤には、sodium
further guidance on buffer shelf life.
metabisulfiteなどの安定剤を含むものが
あります。これらの安定剤は、光学的、
Buffer reagents can contain a stabilizing
クロマト的に影響を与えるので、安定剤
agent, for example, sodium metabisulphite.
を含まない試薬を購入するようにしてく
These stabilizing agents often affect the
ださい。固体試薬は何度も使用する間に
optical and chromatographic behavior of
汚染の危険があるので、購入する際は、
buffer solutions, so it is often worth buying
必要最小単位での購入を奨めます。
reagents that contain no stabilizer. Containers
of solid reagent are easily contaminated by
repeated use. For this reason, we recommend
that reagents be purchased in low container
weights.
Filtration
Ideally, all HPLC solvents should be filtered
HPLCで用いる移動相は、0.45μmのフィ
ルタでろ過してください。これにより、
through a 0.45 µm filter before use (see
閉塞につながる粒子状物質を取り除くこ
HyperClean™ Filters page 172). This removes
とが出来ます。ろ過後は、溶媒は、ほこ
any particulate matter that may cause blockりなどが混入しないようにリザーバにカ
ages. After filtration, the solvents should be
バー(ふた)つきで保管してください。こ
stored in a covered reservoir to prevent reのろ過により、クロマト分離の他に、
HPLC装置の磨耗・損傷も防げます。ポン
contamination with dust etc. Filtering HPLC
ププランジャ、シール、チェックバルブ
solvents will benefit both your chromatograの寿命が延びます。
phy and the wear and tear of the HPLC system. Pump plungers, seals and check valves
will perform better and lifetimes will be
maximized.
Degassing
Before the freshly prepared mobile phase is
移動相は使用する前に、溶存気体を完全に
脱気すべきである。脱気には、次の3通り
pumped around the HPLC system, it should
の方法があります。
be thoroughly degassed to remove all
dissolved gasses. Dissolved gas can be
removed from solution by:
ヘリウム脱気
• Bubbling
with helium
超音波脱気
• Sonication
• 真空脱気
Vacuum filtration
移動相が脱気されていない場合、低圧の検
If the mobile phase is not degassed, air
出器セル内で気泡が発生することがありま
bubbles can form in the low pressure of the
す。その結果、装置が不安定になり、ベー
detector cell resulting in problems with system
スラインの変動やゴーストピークが生じま
instability, spurious baseline peaks etc.
す。最も効果的な方法は、ヘリウムなどの
The most efficient form of degassing is
溶解度の低いガスによるバブリングで脱気
することです。この方法が使える場合は、
bubbling with helium or another low solubility
分析中、弱くバブリングし続けることを奨
gas. If this method is available, we recommend
めます。これにより、分析時の空気再溶解
that the mobile phase is continually degassed
を防ぐことができます。
at very low levels throughout the analysis.
This will inhibit the re-adsorption of gases
over the analysis time.
Note: Ensure that the solvent reservoir has a vent to the
atmosphere to prevent the build up of pressure inside
the reservoir.
Baseline noise from gas in mobile phase
㪉㪇㪎
www.thermo.com /columns
207
217
HPLC and LC/MS
有機溶媒の性質(対シリカゲル)と混和性
Solvent Properties (vs Silica Gel) and Miscibility
㪉㪇㪏
218
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208
Technical Information
発色団の検出波長と吸収強度
Chromophore Detection Wavelengths
Chromophores are light absorbing groups.
Their behavior is used to allow the detection
of analytes. They have one or more detection
wavelengths, each of which has a molar
adsorbtivity associated with it. The information contained in the following table is
intended as a guide to common chromophores.
It is not an exhaustive list.
λmax (nm)
εmax (L/m/cm)
Acetylide
-C≡C-
175 – 180
6,000
Aldehyde
-CHO
210
Strong
280 – 300
11 – 18
Chromophore
Amine
-NH2
195
2,800
Azidin
> C=N-
190
5,000
Azo
-N=N-
285 – 400
3 – 25
184
46,700
202
6,900
255
170
Benzene
Carboxyl
-COOH
200 – 210
50 – 70
Ester
-COOR
205
50
Ether
-O-
185
1,000
Ethylene
-C=C-
190
8,000
Ketone
> C=O
195
1,000
270 – 285
18 – 30
220
112,000
275
175
312
5,600
-ONO2
270
12
-(C=C)-2 acyclic
210 – 230
21,000
-(C=C)3
260
35,000
C=C-C=C
219
6,500
C=C-C=N
220
23,000
C=C-C=O
210 – 250
10,000 – 20,000
C=C-NO2
300 – 350
Weak
-C≡N
160
-ONO
220 – 230
1,000 – 2,000
300 – 400
10
Napthalene
Nitrate
Nitrile
Nitro
-NO2
210
Strong
Nitroso
-N=O
302
100
Oxime
-NOH
190
5,000
174
80,000
195
6,000
N
251
1,700
Sulfone
-SO2-
180
Sulfoxide
> S-O
210
1,500
Thioether
-S-
194
4,600
215
1,600
195
1,400
Pyridine
Thiol
-SH
㪉㪇㪐
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209
219
ポリマーチューブの溶剤耐性
19㧚ࡐ࡝ࡑ࡯࠴ࡘ࡯ࡉߩ⠴ṁᇦᕈ
1㧦૶↪น⢻
2㧦ಽᨆᴺଐሽ
3㧦૶↪ਇน
ήශ㧦ਇ᣿
24
㪉㪈㪇210