毒性試験と評価に関する新たな課題へのアプローチ - 国立環境研究所

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毒性試験と評価に関する新たな課題へのアプローチ
- 厚生労働省ナノマテリアル研究の展開 -
菅野 純
国立医薬品食品衛生研究所
安全性生物試験研究センター
毒性部 部長
2012-02-17 化学物質シンポジウム
@ 三田 jk
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項 目
•
•
•
•
イントロダクション
Fiber Carcinogenesis (繊維による発がん)
Systemic effects (全身影響)
Fullerene(フラーレン:C60)
– Fullerene nanowhisker
• Whole body inhalation(WBI)(全身吸入暴露)
– Taquann method
• Carcinogenesis (発がん性:津田班)
– Mesothelin assay
• まとめ
• 今後の物質
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@ 三田 jk
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Nanoparticles tested by MHLW*
1. 非意図的粒子
–
–
Diesel exhaust
Others
2. 意図的粒子
–
–
–
–
Carbon nanotube (Multiwall: MWCNT)
Titanium dioxide
Fullerene
他
*Ministry
of Health Labour and Welfare Research grants
on Risk of Chemical Substances
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@ 三田 jk
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毒性医学的な背景
Medico-toxicological Background (4)
• 粒子状物質による人身事故例 3例
(1)アスベスト発がん(線維状物質発がん)
•
•
•
•
悪性中皮腫 frustrated phagocytosis
肺腺癌 : メカニズム???? 中皮腫の数倍
★閾値が設定できない (threshold is not known to exist)
アスベストの全身分布による有害影響(他臓器発がん・免疫異常)
– Asbestos travels through out the body
(2)トロトラスト
Thorotrast (thorium dioxide, ThO2) 大戦中に用いられたレントゲン造影剤
• 細網内皮系(肝、脾、リンパ節など)に補足される Trapped by RES*
system (liver, spleen, LN, etc)
★人体半減期 Half life = 22 years
• 3~10 nm の粒子である 3~10 nm emulsion**
2012-02-17 化学物質シンポジウム
* reticuloendothelial system
** thanks to Dr. Hakan Wallin for the size info
@ 三田 jk
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毒性医学的な背景
Medico-toxicological Background (4)
• 粒子状物質による人身事故例 3例
(1)アスベスト発がん(線維状物質発がん)
•
•
•
•
悪性中皮腫 frustrated phagocytosis
肺腺癌 : メカニズム???? 中皮腫の数倍
★閾値が設定できない (threshold is not known to exist)
アスベストの全身分布による有害影響(他臓器発がん・免疫異常)
– Asbestos travels through out the body
難分解性・高蓄積性
• 細網内皮系(肝、脾、リンパ節など)に補足される
(2)トロトラスト
Thorotrast (thorium dioxide, ThO2) 大戦中に用いられたレントゲン造影剤
Trapped by RES*
system (liver, spleen, LN, etc)
★人体半減期 Half life = 22 years
• 3~10 nm の粒子である 3~10 nm emulsion**
2012-02-17 化学物質シンポジウム
* reticuloendothelial system
** thanks to Dr. Hakan Wallin for the size info
@ 三田 jk
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毒性医学的な背景
Medico-toxicological Background (5)
(3)溶接工等、フュームによる心筋梗塞・脳梗塞の増加
(疫学)
Exposure to metal welding fume particles and risk for
cardiovascular disease in Denmark: a prospective cohort study.
Ibfelt E, Bonde JP, Hansen J.
Occup Environ Med. 2010 Nov;67(11):772-7.
CONCLUSIONS: This study supports the hypothesis that
exposure to welding processed particles increases the risk for
cardiovascular disease.
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ナノ物質のヒト健康影響に関する研究
厚生労働科学研究費補助金【化学物質リスク研究事業】研究班
FY2004
2005
2006
2007
2008
2011
2010
2009
2012
2013
2014
菅野班
広瀬班(3)
広瀬班(2)
広瀬班 (1)
津田班(1)
津田班(2)
福島班(1)
堤班(1)
今井田班(1)
堤班(2)
藤岡班(1)
伊佐間班(1)
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広瀬班
ナノマテリアルの健康影響評価手法の総合的開発および体内動態を含む基
礎的有害性情報集積に関する研究
•
慢性影響 in vivo
– アスベスト様繊維:長尺及び短尺の焼結型フラーレンウィスカー(FW)単回腹腔内投与一
年間慢性試験
– C60の腹腔内投与による腎影響の解析
– ナノ酸化亜鉛の間質性肺炎の発生機序解明
– アナターゼ型酸化チタンによる肺線維芽細胞等へ影響解析
•
基礎的有害性情報収集
– C60の体内代謝解析
– サイズの異なるMWCNTの気管内投与による体内動態解析手法の開発
– 遺伝毒性
• CNTのBhas細胞を用いたトランスフォーメーション試験
• 肺でのTG遺伝子突然変異、およびDNA付加体の検出
– in vitro試験系開発研究
• 神経幹細胞増殖抑制作用、ミクログリア細胞毒性における金属イオンの関与やサイズの異なる
CNTについての影響を比較検討、
• マクロファージの反応としての活性酸素量やペルオキシダーゼ活性、
• 脂質過酸化量測定による細胞障害性メカニズムの検証と、
• IL-1β産生促進作用における大きさや形状による細胞応答の違いを明らかにする。
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津田班
カーボンナノマテリアルによる肺障害と発がん作用の中期評価法とその作用
の分子機序解析法の開発に関する研究
•
吸入毒性試験に代わる標準的評価法の確立(下記1~4のシステム構築)
•
ラットを用いて種々の炭素ナノマテリアルについて
– 肺内噴霧法
– 単層及および多層カーボンナノチューブ
1. 20週の中期毒性・発がんプロモーション試験
2. 炎症/増殖病変解析のための14日間の短期試験
3. 初代培養肺胞マクロファージおよび気管支上皮培養系によるサイトカインの細胞増殖、炎症、
免疫反応への関与の評価
4. 結果のヒトリスク評価への外挿法を確立する
•
陽性対照
– 中皮腫発がん:MITSUI(MWCNT -7)、クロシドライト(UICC Grade Asbest)
– 肺発がん:カーボンブラック
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今井田班 (先行福島班の継承)
ナノマテリアルのヒト健康影響の評価手法に関する研究
- 全身暴露吸入による肺を主標的とした毒性評価研究 –
NMの全身暴露吸入試験を実施し、用量作用関係を含む有害性情報及びそ
の詳細な病態の解析
•
音響式ダスト発生装置(米国NIOSH考案)の基本概念を導入
– 独自の暴露チャンバー
– 1群最大16匹、3群の実験
•
気管内暴露(並行実施:比較)
•
急性期反応及び慢性反応(背景、経過、要因を経時的に解析)
– 病理組織学的評価(光顕、電顕、免疫染色、他)
– 腫瘍性病変
– 非腫瘍性病変。
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まとめ
1.人(や動物で)の過去の知見から想定される毒性影響を基盤とした試験法
開発と評価
・繊維発がん: 腹腔内投与(モデル系)
・全身分布による影響: 腹腔内投与≒フィルタ付き静脈注射
2.人(や動物で)の過去の知見がない場合
●人に想定される暴露経路(*)による動物実験
→ハザード同定
→メカニズム同定(推定)
→実験動物における用量作用関係
人に対する毒性と用量作用関係の想定
*:吸入(全身、気管内)、経皮、経口
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• Fiber Carcinogenesis (繊維による発がん)
– Mesothelioma(中皮腫)
– Lung adenocarcinoma(肺腺癌)
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MWCNT (Mitsui)
asbestos (crocidolite, 青アスベスト)
c
a
100m
d
100m
10m
b
10m
10m
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Measured at the
Tokyo
Metropolitan
Institute of Public
Health
ヒストグラム
Width
of MWCNT
Diameter
frequency
頻度
frequency
頻度
60
50
40
30
20
10
0
70
90
110
130
150
データ区間
Width
in nm
Width
in
nm
170
ヒストグラム
Length
of MWCNT
Length
120
100
80
60
40
20
0
27.5%
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19
データ区間
Length
in
Length
in m
mm
MWCNT:3mg/animal
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= 1.06 X109 fiber/mouse = 1.86 X108 WHO fiber/mouse)
Mesotheliomagenesis
• Morphology のみからの推論
– 散在性のFiber 貪食Marcophageによる局所炎症が
重要(CD45陰性)
– 類上皮細胞肉芽腫(及びその線維化瘢痕)は直接的
には関係しない
– 肉芽腫形成は中皮腫形成回避に働くのではないか?
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• Systemic effects (全身影響)
– Asbestos (アスベスト)
• Cancer (発がん)
• Immune disorder(免疫疾患)
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多層カーボンナノチューブ(MWCNT)のマウスにおける催奇形性
藤谷知子1)、 大山謙一1)、
江 大1)、 小縣昭夫1)
広瀬明彦2)、
1)東京都健康安全研究センター
2)国立医薬品食品衛生研究所
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西村哲治2)、中
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実験材料及び方法
1) 腹腔内投与試験
実験動物:Crj:CD-1(ICR)マウス
被検物質:多層カーボンナノチューブ(MWCNT),三井製
0, 2, 3, 4, 5mg/kg 2%CMC懸濁
投与方法:妊娠9日1回投与
妊娠18日開腹,胎児観察
2) 気管内投与試験
実験動物:Crj:CD-1(ICR)マウス
被検物質:多層カーボンナノチューブ(MWCNT),三井製
0, 3, 4, 5mg/kg 2%CMC懸濁
投与方法:妊娠9日1回投与
妊娠18日開腹,胎児観察
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• Fullerene(フラーレン:C60)
– Chronic toxicity
• Systemic distribution
• Modification of aggregates by phagocytes
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C60再凝集
(in xylene environment)
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Unpublished data
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• Fullerene nanowhisker(ナノウィスカー)
• Fullerene sintered NW (焼結ナノウィスカー)
– 非晶質化―――不完全である可能性あり
• Luminescent polymer (光ポリマー)
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独立行政法人物質・材料研究機構
先端材料プロセスユニット
フラーレン工学グループ
宮澤 薫一・加藤良栄・平田千佳
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フラーレンナノウィスカーとフラーレンナノチューブ
C60(フラーレン)ナノウィスカー
C60(フラーレン)ナノチューブ
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• Whole body inhalation(WBI)(全身吸入暴露)
– Aerodynamic diameter(空気動力学的直径)
• Intratracheal installation (気管内投与)の限界
• Technology for WBI
– NIOSH type generator (音響式発生器)
– Original Disposable Chamber(ディスポーザブル・チャンバー)
– Taquann method for dispersion(Taquann 検体分散法)
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Aerodynamic diameter( )
• やわらかい繊維状粒子
• エアロゾル:水滴中の状態
– 表面張力による球体化
• 気相中:
– 自然な繊維状を維持
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全身暴露吸入装置の概略(NIOSH方式)
制御パラメーターの設定
制御パラメーターの設定
1.音響エネルギー
1.音響エネルギー
•周波数(10~30Hz)
•周波数(10~30Hz)
•スピーカー電圧(0~1V)
•スピーカー電圧(0~1V)
•PID制御定数
•PID制御定数
(比例、積分、微分)
(比例、積分、微分)
制御装置
パーティクルカウンター
粉塵濃度の測定
(cpm/2.83L/min)
20万cpm/2.83L=70,671cpm/L
2.流量(~20L/min)
暴露チャンバー
NIOSH方式
ダスト発生装置
MOUDI
外気
重量濃度の測定
(mg/m3)
スピーカー
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独自開発
小型チャンバー
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全身吸入の為の検体調整手法開発
• Sample dispersion (分散法)
Taquann method
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Taquann method
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Taquann法は
再懸濁性に
優れている
原末
Taquann
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Taquann処理MWCNT
全身吸入マウスの肺から回収したMWCNT像
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津田班
• Carcinogenesis (発がん性)
in vivo → in vitro
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@ 三田 jk
津田班申請提案図 (H20年2月)
① 発がん2段階モデルによるプロモーション作用の中期評価
0
2週
4週
肺発が
ん物質
20週
肺/胸膜中皮における腫瘍・毒性の発生
他臓器:被検物質全身分布の把握
被検物質肺内噴霧投与
(津田・二口・五十嵐)
② 短期投与試験による炎症/免疫毒性/気管支毒性/増殖性病変の分子病理学的解析
0
3〜10日
被検物質肺内
噴霧投与
肺胞組織
/中皮
mRNA/miRNA/蛋白解析(サイトカインアレイ・RT-PCR)
免疫/蛍光染色による反応蛋白の局在同定
(酒々井・二口・今泉・五十嵐)
③ 貪食マクロファージのin vitro機能、および免疫反応の解析
被検物質
肺
マクロファージ
/気管支上皮
採取
細胞増殖・毒性発現
メカニズム因子の同
定
被検物質貪食マクロファージのmiRNA,
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蛋白解析(サイトカインアレイ・RT-PCR)
@ 三田 jk
(酒々井・今泉・五十嵐)
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Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
④ データのヒ
トへの外挿と
リスク評価
(津田)
TiO2
0
Lung tumor promotion study
2
4
16wk
Saline
TiO2 250ppm
TiO2 500ppm
Animals
: Female human c-Ha-ras proto-oncogene transgenic rats
: DHPN: 0.2% in drinking water
Treatment : nano-size TiO2, rutile type, non-coating, 20nm in diameter,
Intra-tracheal spraying, 0.5ml once/two weeks (Total 7 times)
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Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
50nm
50nm
2μm
50nm
500nm
1μm
TiO2 in alveolar macrophages
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@ 三田 jk
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Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
EM
Element analysis
Titanium
Aggregate of nano sizeTiO2
(agTiO2 )
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@ 三田 jk
TiO2Tsuda
is Project
Phagoctosed
by Alveolar Macrophages
37
& Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
Alveolar macrophage
with TiO2
MIP1α
Proliferation of lung
epithelium cells
Mammary
gland
MIP1α secreted by alveolar macrophage causes proliferation of lung alveolar and mammary epithelium
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@ 三田 jk
Xu …and Tsuda.
Carcinogenesis
38 31, p927, 2010
Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
TiO2 penetration test in vitro
43.6μL of vehicle, 250ppm or 500ppm TiO2 is applied on the
model for 12 hours.
ICP analysis of Ti element
TiO2 (Non coat/pentalan)
Epidermal tissue model
Detection of TiO2
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Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
TiO2 Skin painting Studies
Normal
Rutile
Coating (-)
Damaged
Rutile
Slicone coated
Silicone containig
vehicle
rTiO2
Epidermis
Subcutaneous
tissue
Penetration
No
Carcino‐genesis
No
No
No
2012-02-17 化学物質シンポジウム
@ 三田 jk
No
No
No
No
40
Tsuda Project & Dept. Mol. Toxicol., Nagoya City Univ. Grad. Sch. Med. Sci.
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• Mesothelin assay study
– Mesothelin assay kit
• Serum
• ELISA kit for Human/ Rat/ Mouse
– Developed by Dr. Okio Hino
• Animal study (one year, p53+/- mice)
– by Divison of Cellular and Molecular Toxicology, NIHS
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[email protected]/Tox
・動物
:雄C57BL/6 backのp53+/- マウス、10匹/群で8群構成
・投与
:MWCNT(10μg/animal) Taquann法
&
Vehicle control 各単回腹腔内投与
:生食注に懸濁、オートクレーブ、最終濃度0.1% のtween 80を添加後、sonicationする。
・解剖
:投与後45日間隔で1年まで
・採取-測定
:血清mesothelin測定、病理組織学的検査
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まとめ
1.人(や動物で)の過去の知見から想定される毒性影響を基盤とした試験法
開発と評価
・繊維発がん: 腹腔内投与(モデル系)
・全身分布による影響: 腹腔内投与≒フィルタ付き静脈注射
2.人(や動物で)の過去の知見がない場合
●人に想定される暴露経路(*)による動物実験
→ハザード同定
→メカニズム同定(推定)
→実験動物における用量作用関係
人に対する毒性と用量作用関係の想定
*:吸入(全身、気管内)、経皮、経口
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m-MWCNT
Fullerene whiskers
まとめ
m-MWCNT
C60
1.人(や動物で)の過去の知見から想定される毒性影響を基盤とした試験法
etc
開発と評価
・繊維発がん: 腹腔内投与(モデル系)
・全身分布による影響: 腹腔内投与≒フィルタ付き静脈注射
TiO2
ZnO
2.人(や動物で)の過去の知見がない場合
m-MWCNT
●人に想定される暴露経路(*)による動物実験
Shorter MWCNT
Other CNT
Nano Metals
→ハザード同定
Fullerene whiskers
→メカニズム同定(推定)
Etc.
→実験動物における用量作用関係
人に対する毒性と用量作用関係の想定
*:吸入(全身、気管内)、経皮、経口
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今後の物質
2012-02-17 化学物質シンポジウム
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今後の物質
•
•
•
CNTs
TiO2
ZnO
•
•
•
•
Ag, An, Zn
Graphen
Nano-Cellulose
others
• NM with Specific
Affinity
– DNA/RNA
– Protein
= enzyme inhibition
= antibody-like
= amyloid/ prion-like
Aptamer-conjugated
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47
END
2012-02-17 化学物質シンポジウム
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