X線1分子構造動態情報からの新しい創薬戦略

X線1分子構造動態情報
からの新しい創薬戦略
東京大学大学院 新領域創成科学研究科 物質系専攻
佐々木裕次
ファルマシュプール(株), 東北大学病院臨床試験推進センター
長谷川節雄
生物物理学領域
- 1分子計測分野の進歩が凄まじい Labeling
Non-Labeling
Myosin V
Actin filament
F1-ATPase Single Unit Observation
Nature 386, 299 (1997)
Prestroke state
30ms/f
High-speed AFM Myosin V
Nature 468, 7320 (2010)
次はmoreHigh-speed & 3D High-accuracy
3次元分子内部運動とは何か?
構造が分かっているか?安定構造があるのか?
単体での内部運動
結合後の内部運動
結合前後の内部運動
検出部位を指定
超高速(ナノ秒)超高精度(ピコメートル)
1分子内部運動情報は何をもたらすか!?
(1)分子内部運動という物理情報を初めて高精度に取得
(提案: 量から質への転換、化学計測から物理計測へ)
(2) 分子内部運動を考慮した創薬や薬剤評価の可能性
(提案: 有効な分子内部動態を阻止する薬剤の登場)
(3) 疾患の状況を分子内運動から評価・予測
(提案:1分子内部動態情報を新規バイオマーカーとして)
機能発現=特徴的な分子内部運動
X線1分子追跡法の測定対象:
(Diffracted X-ray Tracking: DXT)
(1) 細胞上膜タンパク質分子(群)
(2) タウタンパク質分子・Aβ(天然変性系)
(3) 膜上GPCR系
(4) 自己免疫系(TCR-MHC系)
(5) DNA結合タンパク質分子
(6) 他の多くの機能性分子対象可
Principle:
Diffracted X-ray Tracking (DXT)
DXT monitors x-ray diffraction from the individual nanocrystal,
which is linked to the individual single protein molecule in bio-systems.
Features:
(1) High Accuracy(-pm=nm/1000)
(2) Time-resolved Information(from ms to ns)
(3) in vivo Measurement
(4) Independent from Chemical Conditions
SR
Laue Spots
Laue Spot Movie
Indicator
Structural Change
We assumed that motions of a specific site in individual proteins
are equal to the observed orientations of nanocrystals.
Two-Dimensional(q & c) Detection
Tilting
θ
White
X-ray
Rotation
White
X-ray
High-accuracy Angle Determination in DXT
θ direction=1 mrad (0.057deg)
χ direction=6 mrad (0.34deg)
Visible light Technique→10deg.
AFM→ 1deg.
Big advantage of DXT
χ
DXT arrangement
Sample
PF-AR NW14A
Image
Intensifier
V7739P (Hamamatsu
Photonics)
ID gap=15 mm
3x1014 photons/s/mrad/0.1%b.w.
Beam size: (150x50μm)
White
X-ray
heater
polyimide film
polyimide film
Aqueous Solution
Gold Nanocrysatal
CCD:
C4880-80(Hamamatsu photonics)
Sample
PF-AR NW14A
(35-60mA)
X-rays
Protein
10mm
gold
Experimental Samples until Now:
DNA
NH2
SH
Light Flash
35C
Au
Si/Mo
Nanocrystal
myosin
C-terminal
N-terminal
GroEL/ES
Actin filament
KcsA
Light Flash
(280nm)
b2-microglobulin
GFP
bR
Important Targets:
Membrane Proteins !!
The gating mechanism of nAChR is not unclear.
AChBP
Neuron cell
Dendrite elongation
action potential
Clustering of Receptor
Sample of DXT:
nAChR and AChBP
Hetero(Homo)-Pentamer
n Nicotinic Acetylcholine Receptors
(nAChR)
Diffracted X-ray Tracking (DXT)
Sasaki et al., Phys. Rev. E 62, 3843–3847 (2000)
Au
Configuration of DXT for AChBP and nAChR
Torpedo
Experimental conditions
ACh:
acetylcholine
BTx:
α-bungarotoxin
agonist
desensitization
antagonist
Free
FAST-DXT 100μs/f
X-rays
shutter
experimental
buffer
[email protected]
Flux: 1015 photons/sec
X-rays
kapton
film
fast-shutter
slit
sample
Image intensifier
V5445P, Hamamatsu photonics
100 mm
Max. time resolution  5 μs/f
CMOS camera
Photoron SA1.1
Gold Nano-crystal does not disturb
functional motion
free condition
40nm in diameter
size of Au-crystal (a.u. Norm. Intensity)
Non-Label
Angular velocity
10-40% decreased
DXT movie & tracking trajectories
χ
θ
beam stopper
beam stopper
θ
χ
beam stopper
beam stopper
χ
DXT trajectories
θ
AChBP: 2D (θ, χ)-motion map
2軸分子内部運動ヒストグラムの見方:
q
β
δ
c
c
α
q
q
α
γ
0.1Å/ms 1.0Å/ms 10.0Å/ms
(θ方向での換算運動幅)
Quasi-in vivo (Interface) Observations
x-ray
ColQ
Laminin
Neural
Agrin
x-ray
x-ray
N-cadherins
Neurexin
Laminin
Nanocrystal
a-Dystroglycan
Nanocrystal
Nanocrystal
Neuroligin
MuSK nAChR
Lrp4
β-Dystroglycan
RATL
Rapsyn
Rapsyn
AMPAR NMDAR
Arcadlin
Stargazin
PSD-95
mGluR
PSD-95
GKAP
Nanocrystal
Utrophin
F-actin
Homer
Shank
Cortactin
F-actin
Next Advanced Technology:
(1)Labeling technique
genetic operation
(2)Simultaneously observation of two nanocrystals
DXTをタウタンパク質分子に適応した例:
(1)現在のアルツハイマー病バイオマーカーは脳脊髄液中タウ
蛋白質,その変化量のみでは早期診断法として不十分!
(提案:量から質への転換、免疫化学計測から物理計測へ)
(2) タウ蛋白は異常な修飾で分子運動性変化が十分予想される!
(提案:高精度分子内部動態情報を新規バイオマーカーに)
(3) 物質量のみでなく新規高感度疾患バイオマーカーの提案!
(提案:コンパクト装置で1分子内部動態情報を)
ターゲット分子の質的変化:
リン酸化、アセチル化
ユビキチン化、糖鎖付加、etc
色々な翻訳後修飾に対応 !!
タウ蛋白のDXTデータ解析結果
His-tag
tau (0N4R)
q
標識ナノ結晶
c
DXTデータ
His-tag
タウ蛋白の3次元(2軸)分子内部動態ヒストグラム
(ビデオレイト)
His-TagTau(2B11)–
His-TagTau(non)
0.01Å 0.1Å 1.0Å
(θ方向での換算運動幅)
X線回折スポット90点からの解析
DXTでタウタンパク質分子内動態計測の新しさ!
(1)3次元1分子内部動態情報(新規バイオマーカー)をナノ秒レベル
検出できる方法はDXT法のみ(感度/安定性でFRETを凌駕)。
(2)ナノ結晶サイズやサンプル溶液粘性で運動速度が制御可能
(早い運動もゆっくり積算(秒)して検出可能を確認済み)
(3)ラボX線光源を用いたDXT装置開発は、極めて画期的
(低速でも計測可能, 自作ナノ結晶回折高効率化を実現)
DXT
ELISA
PET
FRET
FCS
高速1分子検出
◎
×
×
◎
◎
1分子内部動態
◎
×
×
○
△
分子同定定量化
◎
◎
○
○
△
DXTの今後(専用BL化とラボ化の実現):
(1) アルツハイマー病以外にαシヌクレイン(パーキンソン病)
TDP43(FTD, ALS) 等にも適応。早期診断と治療薬開発にも!
(2) 創薬を目的としたハイスループット分子動態促進/阻害剤探索
装置の開発やMD等の計算科学から分子動態予測との連携
(3) 天然変性タンパク質(Intrinsically Disordered Protein)研究
へのルーチン的利用へ波及
(4) 国内外でDXT専用放射光ビームラインを建設し世界普及
(5)「分子内部動態」をX線を用いない超小型計測法の考案/開発
DXT計測は今後に何をもたらすか?
・構造と分子内部運動が最重要という認識
・分子間相互作用を分子内運動から再考
・分子内運動が新しいバイオマーカーに
・in vivoにおける分子内部運動の伝達は?
・分子内部運動計測と分子内部計算の融合
・ある分子内部運動を実現する人工分子創成